[发明专利]一种利用羟基酸脱氢酶制备L-草铵膦的方法

说明书

本发明公开了一种利用羟基酸脱氢酶制备L‑草铵膦的方法，以2‑羟基‑4‑(羟基甲基膦酰基)丁酸为原料，经羟基酸脱氢酶和氨基酸脱氢酶两步催化制备L‑草铵膦。本发明具有以下有益效果：(1)本发明方法以2‑羟基‑4‑(羟基甲基膦酰基)丁酸为底物，经由羟基酸脱氢酶和氨基酸脱氢酶组成的酶催化体系催化获得产物L‑草铵膦，实现了辅酶的自循环、无需要额外的辅酶再生系统以及辅酶再生原料。(2)本发明方法构建了一种全新的生物(酶)催化体系用于生产L‑草铵膦；这种生物催化体系制备L‑草铵膦的工艺路线目前尚未见报导。(3)本发明方法的最终产品中没有任何副产物的生成，从而极大地简化了L‑草铵膦的后续精制工艺，提高了产品总收率。

技术领域

本发明涉及酶工程技术领域，特别是涉及一种利用羟基酸脱氢酶制备L-草铵膦的方法。

背景技术

草铵膦(Phosphinothricin，又名Glufosinate)是一种含磷氨基酸类除草剂，化学名为2-氨基-4-[羟基(甲基)膦酰基]-丁酸。草铵膦是全球第三大灭生性除草剂及第二大转基因作物除草剂，其具有杀草谱广、低毒、活性高和环境相容性好等特点，被广泛应用于非耕地、免耕地、农田作物、水生田等杂草的防除。

草铵膦存在两种光学构型，但只有L-型具有除草活性(Herbicidal compositions[P].Patent application US4265654A，1981)，而且在土壤中易于降解，对环境的危害较小。目前市场上销售的草铵膦一般都是外消旋混合物，如果草铵膦产品能以L-构型的纯光学异构体形式使用，可使草铵膦的使用量降低50％，这将极大地提高原子经济性、降低生产和使用成本、减轻环境压力。因此，开发一种低成本、可工业化的L-草铵膦生产方法，具有极其重要的经济价值和社会价值。

制备光学纯L-草铵膦的方法主要有三种：化学不对称合成法、手性拆分法以及生物催化法。化学不对称合成法从手性原料出发合成光学纯L-草铵膦，多见于实验室研究中，其工艺步骤多、收率低，所用不对称合成试剂和催化剂大多比较昂贵，导致生产成本偏高，不利于大规模制备L-草铵膦。手性拆分法则存在以下固有缺点，一是需要使用手性拆分试剂，二是D-草铵膦需要重新消旋再利用，三是单次拆分收率低，四是工艺比较复杂。

相比之下，生物催化法具有立体选择性严格、反应条件温和、收率高以及产物易分离纯化等优点，是生产L-草铵膦的潜在优势方法。这类反应中的代表就是酶催化的转氨基作用和酶催化的还原胺化，涉及到的酶分别为转氨酶和氨基酸脱氢酶。

Hoechst公司的研究人员对转氨酶工艺做了一系列研究，产品L-草铵膦浓度最高可达420mM，ee值达到99.9％(Schultz A,Taggeselle P,Tripier D,et al.Applied andEnvironmental Microbiology.Jan 1990,56(1):1-6)。中国专利CN1349561筛选得到了能够特异性地催化2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸(PPO)的草酰乙酸转氨酶，可直接利用L-天冬氨酸为氨基供体进行转氨基反应，当底物PPO的浓度为552mmol/L、在消耗大约700mmol/L的L-天冬氨酸的情况下，只生成251.9mmol/L的产物L-草铵膦，与此同时生成了大约234.5mmol/L的杂质丙氨酸，原料PPO的转化率只有52％。此外，中国专利CN105603015公开了一种利用L-丙氨酸为氨基供体、采用特定转氨酶制备L-草铵膦的方法，原料转化率达100％，丙氨酸与底物PPO的摩尔比为1:1～6:1。总的来说，转氨酶虽然具有催化活力高、立体选择性良好等优点，但也存在两大致命缺陷，其一是转氨酶催化的反应为可逆反应，原料PPO不能完全转化为L-草铵膦，只有在过量氨基供体存在的条件下才能达到完全转化；其二是过量的氨基供体残余、以及氨基供体反应后生成的酮酸副产物都给产品的分离精制带来了很大的麻烦。