[发明专利]一种提高环糊精葡萄糖基转移酶分泌表达的优化方法及其应用

说明书

本发明公开了一种提高环糊精葡萄糖基转移酶分泌表达的优化方法及其应用，该方法优化了含CGTase基因的重组大肠杆菌的发酵培养过程，在发酵培养的过程中添加甘氨酸、Ca²⁺、β‑环糊精、牛磺酸和乳糖五种成分，提高了膜通透性，抑制了包涵体的形成，有效促进了环糊精葡萄糖基转移酶蛋白的异源分泌表达，提高了环糊精葡萄糖基转移酶的歧化活力，进一步提高了该酶对线性底物的转化率，从而提高了以麦芽糊精等线性底物生产AA‑2G的产量，更加有利于AA‑2G的工业化生产。

技术领域

本发明涉及一种提高环糊精葡萄糖基转移酶分泌表达的优化方法，属于酶工程和培养基技术领域。

背景技术

维生素C葡萄糖苷，中文名2-O-α-D吡喃葡萄糖基抗坏血酸（AA-2G），是维生素C和淀粉类物质经糖基转移酶作用的产物，由日本林原生物化学研究所与冈山大学药学系共同发现。维生素C葡萄糖苷为维生素C的糖类衍生物，主要作为美白添加剂应用于化妆品中，并且具有优良的稳定性和抗氧化性，是较好的L-抗坏血酸替代品。

目前，应用于化妆品的AA-2G大部分由日本林原公司提供，具有市场垄断地位。AA-2G的价格昂贵，大约是维生素C的100多倍。因此优化适合生产AA-2G的糖基转移酶活性对于推动我国AA-2G的工业化生产具有重要的意义。

最具工业化前景、用于生产AA-2G的糖基转移酶为环糊精葡萄糖基转移酶（CGTase）。CGTase为α-淀粉酶家族的主要成员，作为一种多功能酶，主要催化四种反应，包括三种转糖基反应-环化反应、歧化反应、偶合反应以及一种水解反应。环化反应作为分子内转糖基反应，其原理主要是将线状麦芽低聚糖的非还原末端与同一分子内的还原性末端结合生成环糊精；歧化反应的原理主要是将线状麦芽低聚糖断裂，其中一部分转移至另一线状受体上；偶合反应作为环化反应的逆反应，其原理为断裂环糊精的环状结构并使之与线状低聚糖结合；水解反应主要是将线状低聚糖分子与水分子结合；其中歧化反应占据主导地位。CGTase催化合成AA-2G的机理主要是利用偶合和歧化两种特异性转糖苷反应将糖基供体上的葡萄糖基连接到维生素C的C-2上。目前常用的糖基供体主要有α-环糊精、β-环糊精、麦芽糊精、可溶性淀粉、麦芽糖等，环糊精合成AA-2G的转化率较高，但α-环糊精价格昂贵、β-环糊精难溶于水，所以从生产成本考虑，两者均不适于大规模生产AA-2G；而麦芽糊精等线性底物合成AA-2G的转化率低，线状底物主要是通过CGTase催化歧化反应合成AA-2G。因此提高CGTase的歧化活力对AA-2G的工业化生产具有重要意义。

大肠杆菌具有遗传背景清楚、生长速度快和表达量高等优点，是目前基因表达技术中应用最广泛的表达系统。然而，由于大肠杆菌过高的表达水平以及缺乏真核生物的蛋白加工体系，常常容易导致错误折叠的蛋白聚集形成包涵体，产生没有活性的酶；且大肠杆菌具有双膜结构-内膜和外膜，外膜包含脂多糖，脂多糖通常被认为是可以引起人类和其他哺乳动物发热的一种内毒素。常用的促进蛋白可溶性表达的方法有降低蛋白合成速度和优化培养条件，如李兆丰2009年发表的博士论文“软化类芽孢杆菌α-环糊精葡萄糖基转移酶在大肠杆菌中的表达及其产物特异性分析”一文中提出的提高CGTase胞外酶活的方法为先低温诱导后高温分泌以及在发酵培养基中添加150 mM甘氨酸和20 mM Ca²⁺，虽然提高了CGTase胞外酶活，但较多的Ca²⁺稳定外膜的脂多糖，对后续内毒素的去除不利。如王蕾2018年发表的博士论文“环糊精葡萄糖基转移酶的产物特异性分子改造及发酵制备研究”一文中提出乳糖作为诱导剂能够诱导CGTase在重组大肠杆菌中的表达；环糊精在蛋白质复性再折叠过程中，可与蛋白肽链中侧链疏水的氨基酸特别是芳香族氨基酸形成可逆的包埋复合物，从而抑制因疏水聚集而介导的蛋白聚集体或包涵体的生成，使更多的蛋白肽链折叠成有活性的蛋白。

牛磺酸是由哺乳动物的胰腺通过转化半胱氨酸产生的天然氨基磺酸。其具有调节细胞中钙离子的性质，因此在眼用组合物中添加牛磺酸可预防黄斑变性。牛磺酸还能够维持细胞内外渗透压平衡、保护细胞膜。目前，未见牛磺酸能提高CGTase歧化活力的相关报道。

发明内容