[发明专利]菌种ZFM54的获取方法

权利要求书

1.一菌种ZFM54的获取方法，其特征在于，包括：

(A)从婴儿粪便中分离乳酸菌；

(B)菌种的活化和保藏；

(C)指示菌的培养；

(D)乳酸菌初筛；

(E)产细菌素乳酸菌复筛；以及

(F)菌种鉴定。

2.根据权利要求1所述的菌种ZFM54的获取方法，其中在所述步骤(A)中，在无菌条件下，取初生婴儿粪便用1mL灭菌生理盐水稀释，振荡使其充分混匀后静置，取100μL上清涂布到添加有2％碳酸钙的MRS固体培养基平板上，倒置于37℃培养箱中厌氧培养36～48h。

3.根据权利要求1所述的菌种ZFM54的获取方法，其中在所述步骤(B)中，初步判定为乳酸菌的单菌落，接种到10mL MRS液体培养基中于37℃条件下培养24h，再以1％(v/v)的接种量进行两次传代培养，活化后编号保种，取700μL菌液加上300μL灭菌甘油于-80℃保藏菌株。

4.根据权利要求3所述的菌种ZFM54的获取方法，其中MRS培养基：牛肉膏10g，葡萄糖20g，蛋白胨10g，酵母提取物5g，柠檬酸三铵3g，磷酸氢二钾2g，无水乙酸钠5g，七水硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，吐温80 1mL，溶于超纯水并定容至1L，调节培养基pH为6.5，121℃高压灭菌15min。

5.根据权利要求3所述的菌种ZFM54的获取方法，其中在所述步骤(C)中，将保藏在-80℃甘油管中的各指示菌菌种，分别划线于LB固体培养基平板上，在各自的最适温度下培养至出现明显单菌落，挑取单菌落接种于LB液体培养基中摇床振荡培养至对数期。

6.根据权利要求5所述的菌种ZFM54的获取方法，其中LB培养基：氯化钠10g，蛋白胨10g，酵母提取物5g，超纯水溶解并定容至1L，调节培养基pH为7，121℃高压灭菌15min。

7.根据权利要求1所述的菌种ZFM54的获取方法，其中在所述步骤(D)中，将活化好的乳酸菌菌株按照1％比例分别接种于10mL MRS液体培养基中，在37℃条件下静置培养24h后，4℃下8000r/min离心20min获得上清液，发酵上清液采用牛津杯琼脂扩散法测试抑菌活性。

8.根据权利要求7所述的菌种ZFM54的获取方法，其中牛津杯琼脂扩散法测试方法包括步骤：(1)将灭过菌的LB半固体培养基加热使其充分融化，轻轻振荡混匀，并置于55℃水浴锅中恒温防止琼脂凝固；(2)将灭过菌的牛津杯间隔均匀地放置在一次性培养皿上；(3)将指示菌在漩涡振荡器中振荡混匀，待LB半固体培养基冷却到45℃左右后按1％(v/v)的接种量将指示菌菌悬液加入到15mL半固体培养基中，充分混匀后倒入培养皿中，轻轻旋转平皿使其均匀覆盖平皿表面，注意不要将培养基倒入牛津杯中；(4)待半固体培养基完全冷却凝固后，用灭菌的镊子将牛津杯小心拔出，制成带圆柱形孔洞的含菌平板；(5)在每个孔洞中加入100μL待测样品后，将平板置于4℃冰箱使样品充分扩散4h，然后按照不同指示菌各自的最适培养条件培养12h；(6)用游标卡尺测量抑菌圈的直径并记录。

9.根据权利要求1所述的菌种ZFM54的获取方法，其中在所述步骤(E)中包括步骤：排除有机酸的干扰，首先测定ZFM54发酵上清液的pH，然后用1M氢氧化钠溶液将发酵上清液调至pH5.0，以用乳酸和醋酸调至相同pH的无菌MRS培养基为对照，对藤黄微球菌10209进行牛津杯琼脂扩散法抑菌试验，测量抑菌圈直径大小，比较抑菌活性区别。