[发明专利]一种L-苏氨酸转醛酶突变体的高通量快速筛选方法

权利要求书

1.一种L-苏氨酸转醛酶突变体的高通量快速筛选方法，其特征在于：通过如下步骤筛选：

步骤一、配制试剂

从L-苏氨酸转醛酶突变库中随机挑取突变体单克隆，配制L-苏氨酸转醛酶全细胞反应液，用于合成(2S,3R)-对甲砜基苯丝氨酸；

取对甲砜基苯甲醛，L-苏氨酸，磷酸吡哆醛配制转醛反应液，用于合成(2S,3R)-对甲砜基苯丝氨酸；

取乙醇脱氢酶母液，还原型辅酶Ⅰ母液，配制乙醇脱氢酶反应液，用于(2S,3R)-对甲砜基苯丝氨酸合成后乙醛还原成乙醇的反应；

步骤二、乙醛标准曲线的绘制

取乙醛及乙醇脱氢酶反应液，随即置于酶标仪中检测OD_340nm随时间的变化情况，每2s读取一次，读取30次，计算OD_340nm下降的平均反应速率V_OD340nm，以乙醛浓度为自变量x，V_OD340nm为因变量y，绘制散点图，得到回归方程y＝ax，a为所得斜率；

步骤三、L-苏氨酸转醛酶突变体酶活性测定

转醛反应液、L-苏氨酸转醛酶突变体全细胞反应液，充分混匀、反应结束后，离心除去细胞沉淀，收集反应上清液，反应上清液根据产物乙醛的浓度进行相应倍数n稀释，使得乙醛的浓度在0-10mM之间；

取上清液和乙醇脱氢酶反应液，随即置于酶标仪中检测OD_340nm随时间的变化情况，每2s读取一次，读取30次，计算OD_340nm下降的平均速率V_OD340nm；

步骤四、筛选

通过V_OD340nm计算得到反应液中乙醛的浓度，C_{(2S,3R)-对甲砜基苯丝氨酸}＝C_(乙醛)＝V_OD340nm/a×n，通过对乙醛浓度的判断从而对L-苏氨酸转醛酶突变体的催化活性进行快速筛选，即以乙醛浓度的高低来筛选相应活性高低的L-苏氨酸转醛酶突变体。

2.根据权利要求1所述的一种L-苏氨酸转醛酶突变体的高通量快速筛选方法，其特征在于：所述L-苏氨酸转醛酶全细胞反应液的配制具体为：从L-苏氨酸转醛酶突变库中随机挑取突变体单克隆，接种到48孔0.3mL LB液体培养基且含50μg/mL卡那霉素的深孔板中，37℃，180rpm过夜培养；第二天吸取50μL细胞培养液转接到另一个48孔含950μL LB液体培养基且含50μg/mL卡那霉素的深孔板中，37℃，200rpm振荡培养2-3h；加入IPTG至终浓度为0.1mM，30℃诱导8h后停止培养；在4℃条件下4000rpm离心10min，离心收集BL21(DE3)菌体，加入100μL、100mM、pH 7.0的Tris-HCl缓冲液重悬，-80℃保存。

3.根据权利要求1所述的一种L-苏氨酸转醛酶突变体的高通量快速筛选方法，其特征在于：所述转醛反应液的配制具体为：称取0.184g、1mM的对甲砜基苯甲醛，0.238g、2mM的L-苏氨酸，6.1mg、25μM磷酸吡哆醛，用100mM，pH 7.0的Tris-HCl缓冲液定容到100mL，现配现用。

4.根据权利要求3所述的一种L-苏氨酸转醛酶突变体的高通量快速筛选方法，其特征在于：所述对甲砜基苯甲醛事先加热溶解于10mL乙腈。

5.根据权利要求1所述的一种L-苏氨酸转醛酶突变体的高通量快速筛选方法，其特征在于：所述乙醇脱氢酶反应液的配制具体为：取100μL、5000U/mL的乙醇脱氢酶母液，100μL、15mg/mL的NADH母液，用100mM，pH 7.0的Tris-HCl缓冲液定容至10mL，2～6℃保存，现配现用。

6.根据权利要求1所述的一种L-苏氨酸转醛酶突变体的高通量快速筛选方法，其特征在于：所述乙醛标准曲线的绘制具体为：取40％乙醛母液，分别稀释配制0、1、2、4、6、8、10mM乙醛工作溶液；在96孔板中加入20μL乙醛工作液，180μL乙醇脱氢酶反应液，马上置于酶标仪中检测OD_340nm随时间的变化情况，每2s读取一次，读取30次，计算OD_340nm下降的平均反应速率V_OD340nm；以乙醛浓度为自变量x，V_OD340nm为因变量y，绘制散点图，得到回归方程y＝ax。