[发明专利]一种L-苏氨酸转醛酶突变体的高通量快速筛选方法

说明书

本发明公开了一种L‑苏氨酸转醛酶突变体的高通量快速筛选方法，属于生物化学和酶工程领域。本发明取乙醛及乙醇脱氢酶反应液，随即置于酶标仪中检测OD_340nm随时间的变化情况，计算OD_340nm下降的平均反应速率V_OD340nm，以乙醛浓度为自变量x，V_OD340nm为因变量y，得到回归方程y＝ax，以及乙醛标准曲线。转醛反应液、L‑苏氨酸转醛酶突变体全细胞反应液，充分混匀反应结束后，离心除去细胞沉淀，取上清液和乙醇脱氢酶反应液，随即置于酶标仪中检测OD_340nm随时间的变化情况，计算OD_340nm下降的平均速率V_OD340nm；通过V_OD340nm计算得到反应液中乙醛的浓度，以乙醛浓度的高低来筛选L‑苏氨酸转醛酶突变体。本发明不受反应液中的杂质干扰，灵敏度和准确性高，重复性好，操作简便，便于推广应用。

技术领域

本发明属于生物化学和酶工程领域，具体涉及一种L-苏氨酸转醛酶突变体的高通量快速筛选方法。

背景技术

L-苏氨酸转醛酶(LTTA)为丝氨酸羟甲基转移酶家族蛋白，能不对称催化对甲砜基苯甲醛和L-苏氨酸合成(2S,3R)-对甲砜基苯丝氨酸。(2S,3R)-对甲砜基苯丝氨酸是合成β-氨基醇类抗生素甲砜霉素和氟苯尼考的关键手性中间体，近年来，氟苯尼考的需求日益增加，位列10大出口药物之一。

目前已报道的LTTA催化效率低(最大转化底物浓度仅为20mM)，达不到工业化生产的要求。天然酶普遍存在立体/区域选择性差、底物谱窄、催化效率低等问题，严重阻碍了生物催化剂的应用，通过分子改造提高酶的稳定性、催化活性及选择性是目前常用的手段。但天然酶的改造或构建新的非天然酶，需要对构建的人工突变体库进行高通量定向筛选以获得性能优异的突变酶。

现有技术筛选突变的LTTA主要通过将筛选对象即突变的LTTA作为合成(2S,3R)-对甲砜基苯丝氨酸的催化剂，通过检测(2S,3R)-对甲砜基苯丝氨酸的含量筛选LTTA突变体。

现有技术检测(2S,3R)-对甲砜基苯丝氨酸主要是通过高效液相色谱(HPLC)或核磁共振的方法，操作费时费力，效率低，不适用于LTTA突变体的高通量快速筛选。

发明内容

针对现有技术筛选L-苏氨酸转醛酶突变体操作费时费力，效率低，不适用于L-苏氨酸转醛酶突变体的高通量快速筛选的问题，本发明提供了一种L-苏氨酸转醛酶(LTTA)突变体的高通量快速筛选方法，具体如下：

一种L-苏氨酸转醛酶突变体的高通量快速筛选方法，通过如下步骤筛选：

步骤一、配制试剂

从L-苏氨酸转醛酶突变库中随机挑取突变体单克隆，配制L-苏氨酸转醛酶全细胞反应液，用于合成(2S,3R)-对甲砜基苯丝氨酸；

取对甲砜基苯甲醛，L-苏氨酸，磷酸吡哆醛配制转醛反应液，用于合成(2S,3R)-对甲砜基苯丝氨酸；

取乙醇脱氢酶母液，还原型辅酶Ⅰ母液，配制乙醇脱氢酶反应液，用于(2S,3R)-对甲砜基苯丝氨酸合成后乙醛还原成乙醇的反应；

步骤二、乙醛标准曲线的绘制

取乙醛及乙醇脱氢酶反应液，随即置于酶标仪中检测OD_340nm随时间的变化情况，每2s读取一次，读取30次，计算OD_340nm下降的平均反应速率V_OD340nm，以乙醛浓度为自变量x，V_OD340nm为因变量y，绘制散点图，得到回归方程y＝ax，a为所得斜率；

步骤三、L-苏氨酸转醛酶突变体酶活性测定