[发明专利]基于纳米孔测序平台的痰液样本建库方法、鉴定方法及试剂盒

权利要求书

1.一种痰液样本的建库方法，其特征在于，所述方法包括不完全去宿主DNA的步骤和不经过PCR扩增直接建库的步骤；

所述不完全去宿主DNA的步骤如下：

样本离心：取痰液样本，离心；

宿主DNA游离：PBS重悬，添加皂素至终浓度0.22％，室温孵育；加NaCl震荡；

宿主DNA降解：PBS重悬后，添加HL-SAN酶至终浓度47.9U/mL，室温孵育；

菌体收集：PBS混匀，离心弃上清；

所述不经过PCR扩增直接建库基于ONT建库试剂盒SQK-RBK004，其步骤如下：

1)打断加barcode：

加样体系，200μL PCR小管：

去宿主DNA 400ng，补足体积至7.5μL；

条形码RB01-12，2.5μL；

反应体系：30℃，1min，80℃1min；

2)混样+纯化：混样总质量为1-1.8μg，每个样本用量视具体浓度而定，1×的磁珠纯化，13μL pH 7.5-8.0的10mM Tris-HCl洗脱；

3)加接头：向上述10μL样本中加1μL RAP，室温反应10min；

所述条形码RB01-12和RAP均来自ONT建库试剂盒SQK-RBK004。

2.根据权利要求1所述的痰液样本的建库方法，其特征在于，所述不完全去宿主DNA的步骤包括：

1)取200μL样本加入2ml圆底离心管，加入1ml解稠剂；

2)涡旋震荡后，42℃、400rpm震荡孵育5min，12000g离心5min；

3)弃掉上清，250μL PBS重悬沉淀；

4)加入200μL 0.5％皂苷，终浓度0.22％，在旋转混匀仪上室温旋转10min；

5)加入350μL水，用枪吹打混匀，30s后加12μL 5M NaCl，立刻震荡；

6)加800μL HL-SAN buffer用枪吹打混匀；所述HL-SAN buffer为5M NaCl，100mMMgCl2水溶液；

7)加3μL HL-SAN立即混匀，HL-SAN终浓度47.9U/mL，37℃、800rpm孵育15min；

8)加800μL PBS，用枪吹打混匀，12000g离心3min；

9)弃上清。