[发明专利]基于纳米孔测序平台的痰液样本建库方法、鉴定方法及试剂盒有效

专利信息
申请号: 201911343496.1 申请日: 2018-12-13
公开(公告)号: CN111304287B 公开(公告)日: 2020-09-15
发明(设计)人: 张烨;程晨;周水莲;梁晓雪;胡龙;李杜衡;涂浩波;任用 申请(专利权)人: 北京先声医学检验实验室有限公司;江苏先声医学诊断有限公司;南京先声医学检验有限公司
主分类号: C12Q1/6806 分类号: C12Q1/6806;C12Q1/6869;C40B50/06
代理公司: 北京超凡宏宇专利代理事务所(特殊普通合伙) 11463 代理人: 李双艳
地址: 100000 北京市海淀区*** 国省代码: 北京;11
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摘要:
搜索关键词: 基于 纳米 孔测序 平台 样本 方法 鉴定 试剂盒
【说明书】:

本发明涉及基于纳米孔测序平台的痰液样本建库方法、鉴定方法及试剂盒。本发明所述方法是基于纳米孔测序平台结合不完全去宿主,对人体和动物体宏基因组样本进行去宿主前处理以及样本建库,进而用于宏基因组的测序鉴定。本发明所述方法相比于传统流程更简易快捷且满足合理检出需求,省略鉴定过程中建库PCR等流程,排除因PCR扩增导致的偏向性,能够更加真实准确地鉴定宏基因组微生物。

本分案申请是基于申请号为201811528417.X,申请日为2018年12月13日,发明名称为“基于纳米孔测序平台的宏基因组样本建库方法、鉴定方法及试剂盒”的中国专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及宏基因组鉴定领域,具体而言,涉及基于纳米孔测序平台的痰液样本建库方法、鉴定方法及试剂盒。

背景技术

宏基因组测序鉴定相较于传统的培养鉴定方法,具有鉴定周期短、对操作及鉴定人员的技术水平要求低等优势。而且宏基因组测序克服了很多不能培养的微生物的鉴定弊端,被越来越多地应用于微生物鉴定中,特别是不明原因病原微生物的鉴定。目前主流的宏基因组测序方法主要是高通量测序方法,包括二代测序和三代测序。二代测序鉴定存在不少问题,比如:二代测序的鉴定通常从样本到结果的周期较长(72h);测序读长短,增加生信拼接的难度和时长;测序仪投入大,通常需要多样本合并测序以降低成本;三代测序如纳米孔测序以其包括超长序列读长、实时数据产生和生信分析和设备小巧便携等卓越的特征,似乎已是目前比较快捷方便的宏基因组研究方法。

但无论是二代测序还是三代测序,高通量测序都是基于样本基因组的,但在大多数的临床样本中,由于炎症反应等,往往存在大量宿主DNA,病原体DNA只占很少的一部分。因此,得到的测序数据中只有很小的一部分能够用于真正的物种和耐药基因鉴定,并且从大量的原始数据中通过生物信息学方法,过滤掉宿主序列需要大量的计算能力且耗时较长,也会影响临床样本中低丰度病原体鉴定的敏感性。

目前基于纳米孔测序平台开发的快速鉴定流程中,英国的Grady教授(DOI:https://doi.org/10.1101/387548)团队开发的针对感染样本的湿实验去宿主结合快速PCR条形码合并建库的流程是目前最为成熟的技术路线(见图1)。Grady的方法,首先通过破坏宿主细胞膜游离宿主DNA,再通过盐依赖的HL-SAN酶降解宿主DNA,离心收集细菌为主的微生物菌体,再针对细菌DNA进行提取,通常经过这个过程后得到的核酸量往往很低。因此,采用了起始量要求较低(1-5ng)的快速PCR建库试剂盒,先通过转座酶加上条形码,再通过一步全基因组PCR扩增来提高DNA总量,最后通过快速接头连接即可完成建库,上机测序数据实时basecalling,2h的总数据即可成功完成鉴定细菌病原体。

但该方法存在几个不足之处:

首先,在整个湿实验过程中存在一些必须的纯化步骤,所以整体流程并不像文章中呈现的可以在4h完成,根据实际检验,全流程需要5.5h完成;其次,由于去宿主DNA步骤尽量去除了样本中绝大部分的宿主DNA,导致样本的提取浓度往往极低。例如,在对于样本建库过程中由于PCR失败而无法继续建库;更重要的是,由于建库过程中存在的PCR步骤,无法避免地引入扩增偏向性,导致对于一些GC含量高的细菌的鉴定出现严重问题,菌种丰度比例严重失衡。

可见,本领域仍亟需一种更为高效便捷的宏基因组的鉴定方法。有鉴于此,特提出本发明。

发明内容

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