[发明专利]一种检测鸡OASL启动子活性方法

说明书

本发明涉及一种检测鸡OASL启动子活性方法，设计扩增出OASL启动子片段的引物，利用限制性内切酶对OASL启动子部分基因片段和pGL3‑basic载体进行双酶切，用T4连接酶连接，转化大肠杆菌，经PCR和测序验证后，获得pGL3‑basic‑OASL报告基因质粒，并用双荧光素酶报告基因试剂盒验证其功能。此发明可检测鸡OASL启动子活性，其具有快速简便、准确灵敏、便于高通量检测等显著优势，对监控禽源病毒对OASL启动子活性影响，以及OASL在不同类型禽源病毒致病过程所起作用具有重要应用价值，填补国内外空白。

技术领域

本发明涉及一种检测鸡OASL启动子活性方法，属于生物技术领域。

背景技术

先天性免疫系统在病毒感染早期起着至关重要的作用。机体感染病毒后，其免疫系统中的模式识别受体识别非己核酸并激活相应的信号通路，从而释放干扰素，激活并上调其下游的ISG分子表达，ISG分子发挥抗病毒作用。OASL(寡腺苷酸合成酶样蛋白)属于ISGs家族中的重要成员，可合成双链RNA活化酶，抑制蛋白质合成，进而发挥抗病毒作用。OASL在宿主抗流感病毒，脑心肌炎病毒，丙型肝炎病毒等病毒中发挥重要作用。本发明克隆了鸡OASL 启动子区域部分序列插入pGL3-basic载体中，构建了pGL3-basic-OASL报告基因质粒，并验证了该启动子被Ⅰ型干扰素以及双链RNA刺激后的活性变化，为进一步探究病毒对OASL的影响，以及OASL在不同类型禽源病毒感染过程做所起作用提供了有力的工具。

发明内容

本发明的目的是在于提供一种检测鸡OASL启动子活性方法，本发明的原理和最核心的关键技术是科学地设计扩增出鸡OASL启动子部分片段的引物，利用限制性内切酶对OASL启动子部分基因片段和pGL3-basic载体进行双酶切，用T4连接酶连接，转化大肠杆菌，经PCR 和测序验证后，获得pGL3-basic-OASL报告基因质粒，并用双荧光素酶报告基因试剂盒验证其功能。

本发明的目的是这样实现的，一种检测鸡OASL启动子活性方法，其特征是：设计扩增 OASL启动子部分片段的引物与pGL3-basic连接,构建荧光素酶报告质粒pGL3-basic-OASL, 并用双荧光素酶报告基因试剂盒验证其功能；包括以下步骤：

1)利用下述扩增鸡OASL启动子部分片段的引物，以CEF的基因组为模板，PCR扩增出 OASL启动子部分基因；

上游引物：5‘CCGCTCGAGCTTGATGGCATGAGTCCTCCTGCC 3’；

下游引物：5‘GGGAAGCTTGCTCCGCCGCCGCTCGCTGCAG 3’；

2)用XhoI和HindⅢ限制性内切酶对上述鸡OASL启动子部分基因和荧光素酶报告载体 pGL3-basic分别进行双酶切，得到酶切产物；

3)酶切产物纯化后经T4连接酶连接后转化并鉴定，获得pGL3-basic-OASL报告基因质粒；

4)用双荧光素酶报告基因试剂盒验证重组质粒pGL3-basic-OASL的功能。

步骤1)中，所述鸡扩增OASL启动子部分片段的引物：上游引物位于OASL起始密码子上游-968～-945位，且在5’端带有XhoI内切酶序列；下游引物位于OASL起始密码子上游-1～-22位，且在5’端带有HindⅢ内切酶序列。

步骤3)中，酶切产物纯化后经T4连接酶连，转化大肠杆菌，经PCR和测序验证后，获得pGL3-basic-OASL报告基因质粒。