[发明专利]引物探针组合、试剂盒及其用于检测ACTN3基因突变的应用

权利要求书

1.引物探针组合，其特征在于，所述引物包括FIP、BIP、Primer F和Primer R；所述探针包括Probe-wild-A、Probe-mutant-A、Probe-wild-B和Probe-mutant-B；

所述FIP的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示；

所述BIP的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示；

所述PrimerF的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示；

所述Primer R的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示；

所述Probe-wild-A的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；

所述Probe-mutant-A的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；

所述Probe-wild-B的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；

所述Probe-mutant-B的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。

2.如权利要求1所述的引物探针组合在制备检测ACTN3基因突变的试剂或试剂盒的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述ACTN3基因突变位于rs1815739。

4.如权利要求1所述的引物探针组合在制备检测运动员的耐力性能和/或训练成果的试剂或试剂盒中的应用。

5.包括如权利要求1所述的引物探针组合的试剂盒。

6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，还包括Ampligase热稳定DNA连接酶。

7.检测运动员的耐力性能和/或训练成果的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1、提取待测样品的DNA；

步骤2、以所述待测样品的DNA为模板，利用如权利要求1所述的引物探针组合或如权利要求5或6所述的试剂盒，扩增；

步骤3、根据步骤2中所述扩增的结果判定所述待测样品的耐力性能和/或训练成果。

8.如权利要求7所述的方法，其特种在于，所述判定的标准为：

(1)当Wild-DNA探针先出现荧光信号Mutant-DNA探针不出现荧光信号时，样品测序结果显示SNP位点存在单一的胞嘧啶C碱基信号，鉴定为ACTN3野生纯合子DNA；

(2)当Mutant-DNA探针先出现荧光信号Wild-DNA探针不出现荧光信号，样品测序结果显示SNP位点存在单一的胸腺嘧啶T碱基信号，鉴定为ACTN3突变纯合子；

(3)用Mutant-DNA探针和Wild-DNA探针DNA检测荧光曲线POI值趋向一致时，测序结果显示SNP位点同时产生胞嘧啶和胸腺嘧啶C/T碱基信号，鉴定为ACTN3杂合子。

9.如权利要求7或8所述的方法，其特种在于，所述扩增包括连接反应和LAMP反应；

10μL的所述连接反应的体系中包含1μL 10×Ampligase反应缓冲液(200mM Tris-HCl，pH＝8.3，250mM KCl，100mM MgCl2，5mM NAD，0.1％Triton X-100)，1U Ampligase热稳定DNA Ligase，1μL 1μM如权利要求1所述的引物探针组合，不同浓度的1μL DNA或人基因组DNA，5.8μL H₂O，在95℃下加热3分钟，在65℃下加热30min；

所述LAMP反应为：取所述连接反应的产物2μL，加入0.4μM FIP和BIP引物，2.5mM dNTPs0.8μL，2μL甜菜碱，0.8μL 10×ThermoPol反应缓冲液(包含200mM Tris-HCl，100mM KCl，100mM(NH4)2SO4，20mM MgSO4和1％Triton X-100、pH 8.8)，然后迅速加入含有0.2μL 10×ThermoPol反应缓冲液、0.2μL 20×SYBR Green I，2U Bst DNA聚合酶大片段和H2O的混合溶液，溶液最终体积为10μL，将最终的混合溶液在65℃下进行LAMP反应，每隔1min检测和采集实时荧光强度数据。