[发明专利]引物探针组合、试剂盒及其用于检测ACTN3基因突变的应用

说明书

本发明涉及生物技术领域，特别涉及引物探针组合、试剂盒及其用于检测ACTN3基因突变的应用。本发明利用连接酶反应提高了单碱基错配的识别能力，利用LAMP获得高灵敏度，从而建立了基于连接酶的LAMP检测SNP的新方法，该方法可以检测到浓度为100aM的DNA。同时我们将此方法应用于人全血基因组DNA样品检测，获得了与DNA测序一致的结果；该方法对基因突变具有很高的选择性，可测定0.1％突变频率。例如选拔优秀运动员时，需进行能力评定，可以通过检测其血液中有氧能力、代谢效率、训练敏感性、心脏猝死和运动损伤风险等相关基因的SNP类型，对其未来运动能力水平和运动风险进行预测。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及引物探针组合、试剂盒及其用于检测ACTN3基因突变的应用。

背景技术

人类基因组中最常见的基因突变是SNP。人类基因组中总共有300万个 SNP，平均每1000个碱基中就有一个SNP，所以SNP是人类基因组中密度最大的遗传标记。SNP发生频率较高，被认为是继微卫星之后的新一代遗传学标记，在医学遗传学、药物遗传学、疾病遗传学、疾病诊断学以及人类进化等研究领域都有着很高的研究价值和应用前景。ACTN3基因的SNPs与人体运动能力潜在相关，ACTN3R77X是ACTN3基因位于rs1815739位置的多态性，控制了α-肌动蛋白-3的合成，这是一种Z结构蛋白，主要存在于快肌肉纤维中，通过加速糖酵解和促进“爆发性”强收缩为肌肉提供能量。ACTN3突变纯合子因为基因突变造成了α-肌动蛋白-3早期停止密码子完全缺失，导致蛋白表达丧失，使得肌肉代谢向更有效的有氧途径转移，从而提高身体内在耐力性能。最近对运动员和普通人群的研究进一步表明，ACTN3基因还影响骨骼肌对运动训练的适应性反应。检测ACTN3基因的SNP是评价运动员耐力水平和训练的有效手段之一。

在SNP分析中，往往根据实际样品的性质和不同实验目的来确定检测方法。SNP检测方法有多种。在运动科学实验研究中，大多数检测都采用常规方法，如PCR-RFLP和Sanger测序法，这些方法灵敏度高，但操作复杂，分析成本较高。目前，SNP检测主要用PCR、RCA等DNA扩增方法对样品进行信号放大，然后用实时荧光定量PCR进行信号检测，结合了荧光染料放大能力和扩增的高灵敏度，但也存在一些缺点，如操作复杂、选择性低及需要高精确度的温度循环仪器等。环介导等温扩增技术(LAMP)是目前核酸分析的最灵敏的技术，最低可以检测到低于10个拷贝的DNA分子，而且是等温扩增，不需要热循环过程，但存在一些不足之处，一是对单碱基错配的识别能力不高，二是需要将目标序列分为六个区域，设计四个特异性扩增引物，引物设计还要考察二级结构，保证扩增的特异性。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种引物探针组合、试剂盒及其用于检测ACTN3 基因突变的应用。本发明基于连接酶的LAMP方法为SNP检测提供了一种全新的恒温、均相、无标记、高灵敏检测技术，从而实现运动员基因型的高效检测和运动训练学评价。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了引物探针组合，所述引物包括FIP、BIP、Primer F和Primer R；所述探针包括Probe-wild-A、Probe-mutant-A、Probe-wild-B和 Probe-mutant-B；

所述FIP的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示；

所述BIP的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示；

所述Primer F的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示；

所述Primer R的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示；

所述Probe-wild-A的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；

所述Probe-mutant-A的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；