[发明专利]CRISPR/Cas9基因编辑突变体的筛选鉴定方法

权利要求书

1.一种CRISPR/Cas9基因编辑突变体的筛选鉴定方法，其特征在于，该方法适用于烟草基因编辑突变体筛选鉴定，具体包括如下步骤：

（一）获得CRISPR/Cas9基因编辑突变体、并提取突变体基因组DNA

具体CRISPR/Cas9基因编辑突变体获得过程为：

首先构建目标基因的CRISPR/Cas9载体，然后利用电转法将阳性载体转入农杆菌，利用农杆菌介导侵染烟草叶盘，通过共培养以及筛选培养获得愈伤组织及阳性小芽，然后将其移栽至基质中，继续培养至开花结果，此即为CRISPR/Cas9基因编辑突变体；最后采集适量CRISPR/Cas9基因编辑突变体烟株叶片作为样品，提取其基因组DNA备用；

（二）利用高通量测序筛选鉴定基因编辑阳性突变体

利用高通量测序方法对步骤（1）中获得的CRISPR/Cas9基因编辑突变体进行筛选鉴定，具体而言：

（1）针对靶位点设计PCR引物

靶位点设计好之后，在靶位点上下游设计特异性检测引物；

（2）对目的片段进行首轮PCR扩增

以提取的烟草基因组DNA为模板，利用步骤（1）中针对靶位点所设计的PCR引物进行扩增；

对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，胶回收特异性目的条带；

（3）第二轮PCR

高通量测序前，给每个样本的序列中加入一段代表样本来源的Barcode序列标签；

（4）高通量测序

步骤（3）中第二轮PCR反应结束后，把孔板上不同排的样品先混合到其中一排，再将这一排的样品混合在一起，Control孔单独处理；

琼脂糖凝胶电泳检测混合后的PCR产物，胶回收特异性目的条带；

胶回收产物进行高通量测序的要求为：总浓度≥1.0 ng/μL，总质量≥30 ng，总体积≥15 μL；测序数据1.0~1.5 G。

2.如权利要求1所述CRISPR/Cas9基因编辑突变体的筛选鉴定方法，其特征在于，步骤（一）中，所述基因编辑突变体，目标基因为RAX23或MYC2b基因；

就目标基因RAX23、MYC2b，具体靶点序列及所设计引物序列如下：

。

3.如权利要求2所述CRISPR/Cas9基因编辑突变体的筛选鉴定方法，其特征在于，步骤（二）的步骤（1）中，引物设计时，

正向检测引物5’端增加正向前序列P1：5’-GTGCAGTGTCGAGATTGC-3’；

反向检测引物5’端增加反向前序列P2：5’-GATTCAGATGAGTTGATC-3’。

4.如权利要求3所述CRISPR/Cas9基因编辑突变体的筛选鉴定方法，其特征在于，步骤（二）的步骤（3）中，具体引物序列设计为：

RAX23-F：5'-TCTGATAATGATCACATGGTTCA-3'，

RAX23-R：5'-TGTTATTAGACTGGTACCTGAGTG-3'；

MYC2b-F：5'-TGCACGACAGATCCTGCAATAG-3'，

MYC2b-R：5'-CTTCACCTTTGGGATCACGG-3'。

5.如权利要求1所述CRISPR/Cas9基因编辑突变体的筛选鉴定方法，其特征在于，步骤（二）的步骤（4）中，使用Illumina HiSeq2500进行高通量测序。