[发明专利]CRISPR/Cas9基因编辑突变体的筛选鉴定方法

说明书

本申请属于分子生物学技术技术领域，具体涉及一种CRISPR/Cas9基因编辑突变体的筛选鉴定方法。该方法适用于烟草基因编辑突变体筛选鉴定，具体包括：获得CRISPR/Cas9基因编辑突变体、并提取突变体基因组DNA、利用高通量测序筛选鉴定基因编辑阳性突变体等步骤。本申请筛选鉴定CRISPR/Cas9基因编辑突变体过程中，配合高通量测序技术应用，可以部分克服现有鉴定过程繁琐的缺陷，而且具有可以批量应用的优点，尤其是相较于现有常规的Sanger测序，本申请的高通量测序可以大幅降低测序成本，表现出较好的实用价值。

技术领域

本申请属于分子生物学技术技术领域，具体涉及一种CRISPR/Cas9基因编辑突变体的筛选鉴定方法。

背景技术

CRISPR（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats）是生物进化历程中病毒和细菌之间进行斗争而产生的免疫武器，简而言之就是病毒能够把自身的基因整合进入细菌体内，利用细菌为自己的基因进行复制，而细菌为了清除外来入侵的病毒基因，进化出细菌特有的免疫系统——CRISPR系统，细菌可以利用该系统把病毒基因从自身的染色体上切除。基于此原理，目前科学家们开发了一种针对Cas9蛋白操作的技术，可以对多种靶细胞的DNA进行切除，该技术被称之为CRISPR/Cas9基因编辑系统，已成为生命科学领域最热门的技术之一。

现有CRISPR/Cas9基因编辑系统在动植物中的研究应用已经非常成熟，利用该技术能够在全基因组水平进行基因编辑和功能筛选。而基因编辑完成后即需基因编辑后突变体进行筛选鉴定。现有筛选鉴定CRISPR/Cas9基因编辑突变体的常规流程是：①提取基因编辑组织基因组DNA；②以基因组DNA为模板，使用靶点引物进行PCR扩增；③胶回收PCR产物，连接T载体，转化感受态细胞；④随机挑取多个单克隆进行菌落PCR验证，对阳性克隆进行一代测序（Sanger测序），并对测序结果进行比对分析。可以看出，该鉴定流程不仅费时费力，而且成本高。

针对现有筛选鉴定的缺陷，现有技术也有一定改进。例如中国专利（申请号201711351623.3）公开的一种鉴定基因组编辑纯合突变体的方法，其涉及的检测方法是针对突变位点设计特异性引物，通过MSBSP PCR（Mutation sites based specific primersPCR）来筛选鉴定CRISPR/Cas9基因编辑纯合突变体。尽管该方法在时间和成本上相比于常规的鉴定方法有一定的优势，然而尚存在一些局限和不足：①该方法依赖于特异的引物和特异的条件，对于一个新的位点，可能需要花时间和精力摸索比较合适的引物和PCR的条件；②该方法中的两对特异性引物需要严格地设计在gRNA的识别位点处，容易出现引物扩增不特异的情况，所以该方法不太适合于规模化的应用；③该方法原理上是基于在特定位点发生突变，从而与引物不能完全匹配，如果编辑事件发生在PAM序列的下游的情况，就可能检测不到；④对于该方法能不能应用到突变体库的检测，要看具体的情况，如果突变位点已知而且该位点在全基因组范围内比较特异的话，是可以用于突变体的辅助筛选纯合体，但是如果突变体大部分突变位点还是未知的话，这个方法可能暂时还用不上。

综上，针对CRISPR/Cas9基因编辑突变体的筛选鉴定方法仍有必要进行进一步探索，从而为相关实验研究奠定良好技术基础。

发明内容

本申请目的在于提供一种准确筛选鉴定CRISPR/Cas9基因编辑突变体的方法，可为在不同物种中筛选鉴定CRISPR/Cas9基因编辑突变体提供一定技术支撑，从而便于相关基因编辑技术的推广和应用。

本申请所采取的技术方案详述如下。

一种CRISPR/Cas9基因编辑突变体的筛选鉴定方法，具体包括如下步骤：

（一）获得CRISPR/Cas9基因编辑突变体、并提取突变体基因组DNA