[发明专利]合成水杨苷的工程菌及其构建方法和应用

说明书

本发明提供了一种合适水杨苷的工程菌，包括宿主和重组质粒载体，该重组质粒载体上连接有表达编码葡萄糖基转移酶的基因。所述重组质粒载体上还连接有与编码葡萄糖基转移酶的基因共表达的编码羧酸还原酶和磷酰转移酶的基因。所述重组质粒载体上还连接有过表达编码莽草酸激酶、丙酮酸激酶、转酮酶、3‑脱氧‑7‑磷酸庚酸合酶、异分支酸丙酮酸裂解酶和异构分支酸合酶的基因；所述宿主还敲除编码pykA和pykF的基因，以实现水杨苷的增产。本发明还提供一种上述合成水杨苷的工程菌的构建方法和应用。利用上述合成水杨苷的工程菌，以葡萄糖和/或甘油等碳源来生产水杨苷，实现了水杨苷的高效生物合成。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种合成水杨苷的工程菌及其构建方法和应用。

背景技术

水杨苷，英文名称：salicin，英文别名：salicoside，CAS号：138-52-3，分子量286.28，分子式C₁₃H₁₈O₇，结构式为：。

水杨苷是一种水杨醇糖苷，于1828年首次从柳树中分离得到。有研究发现在柳树皮提取物（WBE）中的水杨苷具有抗炎和镇痛作用，因为它逐渐转运到肠道下部，通过肠道细菌水解成水杨醇，吸收后转化为水杨酸。并且它产生解热作用而不会引起胃损伤。因此，对于在接受强效镇痛药如NASAIDs时出现胃部病变的患者，用水杨苷治疗可能是有用的。还有研究发现水杨苷有抗肿瘤和抗血管生成活性，为血管肿瘤的有效治疗提供了新的方向。

天然来源的水杨苷主要是从杨柳科植物中提取得到，例如，中国申请号为CN2015109566550、名称为“一种从白柳皮中提取水杨苷的方法”的发明专利中公开了一种从白柳皮中提取水杨苷的方法，将原料白柳皮采用弱酸-乙醇溶液渗滤提取，可以提高水杨苷在醇液里的溶解度，该方法虽然可以提高水杨苷的提取率，但水杨苷在杨柳科植物中的含量少，提取率仍较低。而且目前，罕有关于利用生物技术生产水杨苷的报道。

发明内容

有鉴于此，确有必要提供一种合成水杨苷的工程菌及其构建方法和应用，以解决上述问题。

本发明的一个目的是从大量生物或微生物体内能够合成水杨苷的酶中筛选出在体外依然具有催化效率的酶来实现水杨苷的异源合成。为此，本发明选择了来源于细菌、真菌或蛋白质工程改造的葡萄糖基转移酶（OSSGT1）的相关基因，通过酶的表达，构建合成水杨苷的工程菌，实现了从水杨醇生物合成水杨苷。

本发明的第二个目的是选择来源于细菌、真菌或蛋白质工程改造的羧酸还原酶（car）、磷酰转移酶（sfp）和葡萄糖基转移酶（OSSGT1）的相关基因，通过这些酶在宿主中的高效表达，构建合成水杨苷的工程菌，从而实现了以水杨酸为原料，生物合成水杨苷。

本发明的第三个目的是选择来源于细菌、真菌或蛋白质工程改造的异分支酸丙酮酸裂解酶（PchB）、异构分支酸合酶（entC）、羧酸还原酶（car）、磷酰转移酶（sfp）和葡萄糖基转移酶（OSSGT1）的相关基因，通过这些酶在宿主中的高效表达，构建合成水杨苷的工程菌，从而实现了利用简单碳源从头生物合成水杨苷。

本发明的第四个目的在于通过抑制竞争途径，模块优化等一系列代谢调控方式来提高从简单碳源为源头生物合成水杨苷的产量。实验结果表明，在正常条件下，水杨苷从简单的碳源利用代谢工程改造菌中能达到100.7±10 mg/L的产量，而在经过优化后，水杨苷利用葡萄糖，甘油这些简单碳源的代谢工程菌能达到4.0±0.03 g/L 的最终产量。

为了实现上述目的，本发明提供一种合成水杨苷的工程菌，包括宿主和重组质粒载体，该重组质粒载体上连接有表达编码葡萄糖基转移酶（OSSGT1）的基因。