[发明专利]一种嵌合抗原受体（CAR）及其应用

说明书

本发明公开了一种PD‑L1 CAR结构，其CAR序列的具体结构为：CD8α前导肽—PD‑L1 scFv—CD8α跨膜区—CD137胞内共刺激域—CD247胞内激活域。其将肿瘤靶向性和T细胞双激活通路分子整合为单一的PD‑L1嵌合受体基因，大大地增加基因修饰T细胞治疗实体瘤的可行性，降低了制备成本，可应用于PD‑L1高表达的实体瘤的治疗中，如肺癌、肝癌、结肠癌等。

技术领域

本发明涉及细胞治疗技术领域，具体涉及一种嵌合抗原受体(CAR)及其应用。

背景技术

T淋巴细胞在发挥抗肿瘤作用时是通过其表面的TCR(T cell receptor，T细胞受体)对肿瘤细胞进行识别和杀伤。然而，研究发现，多种肿瘤细胞的PD-L1(Programmeddeath ligand 1，程序性细胞死亡受体配体1)表达均有上调，PD-L1与T细胞的受体PD-1结合，从而抑制T细胞增殖和活化，使T细胞处于失活状态，造成了肿瘤细胞的免疫逃逸。

体外基因修饰免疫细胞可以使T细胞识别新的靶点并激活而具有杀灭肿瘤细胞的功能。其中嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor，CAR)是由针对某抗原的单链抗体(scFv) 和T细胞激活信号(CD28/CD137，CD3 zeta链)通过基因重组而成。CAR修饰的T细胞可以不依赖MHC识别肿瘤细胞表面的抗原决定簇。CAR结构经过不断的改良优化，CAR-T细胞在血液肿瘤临床试验治疗中显示良好的靶向性、杀伤性和持久性，展示了巨大的发展潜力和应用前景。

针对B细胞膜特异性抗原CD19嵌合抗原受体修饰的T细胞(CD19 CAR-T细胞)多次多中心难治性和复发性ALL临床治疗高达92％完全缓解率，毒副反应(AEs)如B细胞生产障碍，细胞因子释放综合症(CRS)/细胞因子风暴(CS)也是可控的。非常遗憾的是这一新兴技术治疗效果仍然未在实体瘤治疗中得到复制。科学家们在这方面做了很多尝试，往往是疗效不佳及毒副作用太大而无法继续。在设计用于实体瘤治疗的CAR时，最为困难的是选择肿瘤细胞表面特异分子作为靶点；其次实体瘤组织中存在大量髓源性免疫抑制性细胞(MDSC)和Treg，还会诱导巨噬细胞由免疫活化型(M1)向免疫抑制型(M2)转化。CAR T细胞如何克服肿瘤免疫抑制性微环境仍为重大挑战。因此需要通过创造性思维，设计构建CAR-T细胞，实现其在实体肿瘤治疗中的新突破。

发明内容

针对现有技术中所存在的不足，本发明的目的在于提供一种PD-L1特异性单链抗体、含有该单链抗体的嵌合抗原受体、特异性CAR-T细胞及其应用。

本发明所采取的技术方案是：

一种PD-L1单链抗体，其具有：氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的重链可变区(PD-L1 V_H)和氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的轻链可变区(PD-L1 V_L)。

所示重链可变区和轻链可变区通过连接链(Linker)连接，Linker的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

作为优选地，上述的PD-L1单链抗体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

一种PD-L1嵌合抗原受体，其包含以上所述的PD-L1单链抗体。

一种PD-L1嵌合抗原受体，其包含：

(1)PD-L1抗原结合域；

(2)跨膜区：

(3)胞内信号传导域；

所述PD-L1抗原结合域包含上述的PD-L1单链抗体。

所述跨膜区可选自下列膜蛋白的跨膜区：CD8α、FcεRI、TCRα、TCRβ和NKG2D。优选为CD8α的跨膜区。