[发明专利]耐甲醇脂肪酶

说明书

本申请提供了新的具有脂肪酶活性的多肽，其包含如SEQ ID NO:4或6所示的氨基酸序列或上述序列经过取代、缺失或添加至少一个氨基酸后得到的序列。本申请还提供了编码所述多肽的多核苷酸、含有上述多核苷酸的表达载体和宿主细胞。此外，本申请还涉及上述具有脂肪酶活性的多肽的用途。本文公开的多肽能够在高温及高甲醇浓度下快速地制备脂肪酸甲酯，进而用于生物柴油的制备。

发明领域

本申请属于酶工程领域，具体地，涉及具有脂肪酶活性的多肽、其编码核酸，以及包含所述编码核酸的表达载体和宿主细胞。本申请还涉及上述多肽的筛选方法及其用途。

发明背景

脂肪酶(Lipase EC 3..1.1.3)即三酰基甘油酰基水解酶，它催化天然底物油脂水解生成脂肪酸、甘油和甘油单酯或二酯，广泛应用于油脂加工、食品、医药、日化等工业，是重要的工业酶制剂之一。

它能够催化油脂上甘油酯键的水解,也可催化酯交换、酯化、醇解和酸解等反应。微生物来源的脂肪酶由于作用多样、易于培养、产量丰富等特点而被广泛用于工业生产,其中热稳定脂肪酶的研究和开发更是具有重要的商业价值。目前，已知大约有2％的微生物产脂肪酶，能产脂肪酶的微生物至少包括65个属，其中细菌28个属、放线菌4个属、酵母菌10个属、其它真菌23个属。疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)是一种分布广泛、生长上限温度较高的真菌。它能够产生热稳定的具有重要工业价值的脂肪酶Thermomyceslanuginosus lipase(TL)，TL能够被用来进行脂肪酸甲酯话反应生产生物柴油。因为反应过程中甲醇是其中的一种底物，进一步提高TL的耐甲醇能力，有可能进一步使其更加适合甲酯化反应，比如降低用量。

发明概述

第一方面，提供了具有脂肪酶活性的多肽，其包含选自以下的序列或由选自以下的序列组成：

(a)如SEQ ID NO:4或6所示的氨基酸序列，以及

(b)由(a)所述的序列经过取代、缺失或添加至少一个氨基酸后得到的序列，其中由(b)获得的多肽变体仍保持脂肪酶活性。

在一实施方案中，本申请的多肽包含SEQ ID NO:4或6所示的氨基酸序列。在优选的实施方案中，上述多肽由SEQ ID NO:4和6任一项所示的氨基酸序列组成。

第二方面，提供了编码第一方面所述的多肽的多核苷酸，其包含选自以下的序列或由选自以下的序列组成：

(a)核苷酸序列，其编码SEQ ID NO:4或6所示的氨基酸序列、或在SEQ ID NO:4或6中包含至少一个氨基酸取代、缺失或添加的序列；以及

(b)在严格条件下与a)中的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。

在一实施方案中，本申请的多核苷酸包含SEQ ID NO:3或5所示的核苷酸序列。在优选的实施方案中，上述多核苷酸由SEQ ID NO:3或5所示的核苷酸序列组成。

第三方面，提供了表达载体，其包含至少一种第二方面所述的多核苷酸。

在某些实施方案中，本申请的表达载体还包含调节多核苷酸表达的调控序列，其中多核苷酸与调控序列可操作地连接。在具体的实施方案中，所述表达载体为质粒载体。

第四方面，提供了包含第二方面的多核苷酸或第三方面的表达载体的宿主细胞。

在一些实施方案中，宿主细胞为大肠杆菌、或者酵母例如毕赤酵母。

第五方面，提供了第一方面所述的多肽用于进行脂肪酸甲酯化反应或用于制备生物柴油的用途。

在一些实施方案中，在不高于30％浓度，优选15％-25％浓度的甲醇环境进行脂肪酸甲酯化反应或制备生物柴油。