[发明专利]腈水解酶启动子优化表达及应用

说明书

本发明公开了一种pET商品化质粒启动子筛选和置换方法。该方法通过从转录水平对腈水解酶的异源表达进行调节，提高腈水解酶的正确折叠比例，增加可溶性表达，解除包涵体累积对菌体生长的抑制；对启动子突变株进行摇瓶诱导表达，菌体浓度、比酶活和发酵液比酶活分别比商品化质粒提高1.4倍、1.6倍和5.5倍；同时在催化制备加巴喷丁中间体1‑氰基环己基乙酸中的反应中；启动子突变株的催化效率较原菌株提高100％以上。

技术领域

本发明涉及大肠杆菌表达系统启动子筛选、置换及应用，特别涉及一种重组腈水解酶重组表达系统优化，以及该技术制备的酶或重组细胞在制备加巴喷丁中间体1-氰基环己基乙酸中的应用。

背景技术

加巴喷丁，化学名称为1-(氨甲基)-环己基乙酸，是由Warner-Lambert公司原研，1993年在英国首次上市。一般用于治疗癫痫，同时也是治疗糖尿病神经炎、疱疹后的剧痛以及中枢神经性疼痛等神经病痛的首选。早在2005年，加巴喷丁的销售额就达到了30亿美元，占抗癫痫药物销售收入的1/3。按照WTO统计，全球约有5000万癫痫患者，中国癫痫患者在800万以上，终身患病率为0.7％，每年新发病例达40万例左右，全球范围内对加巴喷丁原料药的需求不断增大。目前，加巴喷丁的化合物专利已经到期。

化学工艺路线主要参考专利EP0414262A2，在STEP3和STEP4步骤中，每生产1吨产物需要消耗HCl(0.97吨)，3M NaOH溶液(2.82m³)，乙醇(0.71吨)，甲苯(3.93m³)，甲醇(0.47m³)，两步反应总收率为78％，并且伴有1-(羧甲基)-环己烷羧酸杂质生成。路线如下：

前期工作中，我们从敏捷食酸菌(Acidovorax facilis)ATCC11228基因组中克隆腈水解酶基因nit，构建了E.coli BL21(DE3)/pET28a-T7-nit(利用商品化pET28a质粒构建，为便于区别启动子，记为pET28a-T7-nit)重组菌，利用酶法对上述工艺STEP3和STEP4进行替换，单步收率95％，且无需使用强酸强碱和有机试剂，常温条件下即可完成催化反应，较原工艺有显著优势。路线如下：

上述重组表达系统选用的pET质粒是在科学研究和工业生产中应用最广泛的原核表达载体。pET系列质粒整合了T7启动子，该启动子专一受控于T7 RNA聚合酶，高活性的T7RNA聚合酶合成mRNA的速率比大肠杆菌RNA聚合酶快5倍，二者同时存在时，宿主本底基因的转录无法与T7表达系统竞争，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白；诱导表达后，重组蛋白可在几小时内达到细胞总蛋白50％以上。不过在pET表达系统中常存在表达产率过高的问题，蛋白合成速率过快，没有充足时间进行正确折叠，导致诱导后形成包涵体沉淀，影响菌体生长和蛋白功能表达。研究中防止包涵体主要采用降低诱导温度和诱导剂量的方式，但在很多情况下，优化诱导条件无法缓解包涵体产生(Ruan LT,Zheng RC and ZhengYG.Journal of Industrial MicrobiologyBiotechnology,2016,43,1071-1083)，需要从转录和翻译水平调控表达强度。

本研究构建的E.coli BL21(DE3)/pET28a-T7-nit存在严重的包涵体问题，优化诱导表达条件仍无法缓解，导致菌体生长抑制严重，发酵工艺不稳定和生物催化剂成本偏高等问题。因此利用启动子替换技术对转录强度调控，移除菌体生长瓶颈，对进一步推进加巴喷丁酶法生产工艺有非常重要的意义，同时也为提高重组蛋白可溶性表达提供一个新方案。

发明内容

本发明的目的在于提供一种增加腈水解酶可溶表达的新方案，移除包涵体累积对菌体的生长抑制，提高菌体比酶活和发酵工艺稳定性，为加巴喷丁化学酶法工艺提供更高效的生物催化剂。

本发明采用的技术方案是：