[发明专利]一种利用dITP进行基因随机突变的方法

说明书

本发明公开了一种利用dITP进行基因随机突变的方法，在Taq DNA聚合酶的PCR体系中加入dITP，得到PCR扩增产物；dITP与4种碱基都能够配对，因此在目标基因中引入了大量的突变碱基。将扩增的PCR产物克隆到目的载体，获得目标基因的全位点随机突变文库。本发明的基因突变文库的突变覆盖度高，突变丰度可调，是一种构建基因随机突变文库的良好方法，可用于目标基因定向进化突变筛选。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，特别是涉及一种利用dITP进行基因随机突变的方法。

背景技术

基因突变对于获得特定性能的蛋白质和功能基因至关重要。经典的基因突变技术有随机突变、定点突变等。定点突变虽然能够在特定位点引入特定碱基突变，但一次只能引入一种突变碱基，若进行饱和突变需要合成多条突变引物，导致工作量和成本大大增加。常规随机突变技术主要通过改变Taq DNA聚合酶的PCR体系来实现，例如增加镁离子浓度等。改变PCR体系的缓冲液组成引入的随机突变数量有限，很难保证绝大多数位点都被突变，不能够为后期从随机突变文库中获得目的突变体提供足量的突变体。

发明内容

本发明主要解决的技术问题是提供一种利用dITP进行PCR，大幅增高目标基因随机突变丰度的方法，为从突变文库筛选获得性能改善的突变体提供足量的随机突变体，提高了筛选效率，可用于各种基因的随机突变法功能进化。

为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：提供一种利用dITP进行基因随机突变的方法，包括步骤为：(1)PCR反应中添加一定比例的dITP进行PCR扩增，得到含随机突变碱基的目标基因扩增产物；(2)对步骤(1)得到的扩增产物用限制性核酸内切酶加DNA连接酶法/或DNA重组法等非连接酶依赖性基因克隆技术，将目标基因的随机突变片段克隆到特定载体；(3)将步骤(2)得到的重组载体转化大肠杆菌，经37度培养大肠杆菌，抽提质粒等操作获得目标基因的随机突变文库，即插入了随机突变的目标基因的质粒文库。

在本发明一个较佳实施例中，步骤(1)中所述目标基因的扩增中采用的是聚合酶链式反应PCR，扩增反应缓冲液中包括有扩增目标基因的正向引物、扩增目标基因的反向引物、目标核酸模板分子、低忠实性DNA聚合酶、4种脱氧核苷三磷酸、dITP。

在本发明一个较佳实施例中，步骤(1)中所述dITP与正常dNTP的相对比例可调。

在本发明一个较佳实施例中，步骤(2)中所述随机突变基因克隆到载体的克隆方法可以是经典的限制性内切酶与DNA连接酶的常规克隆方法，也可是各种不依赖于DNA连接酶的克隆方法。

在本发明一个较佳实施例中，步骤(3)还包括对含随机突变目标基因的完整重组质粒载体挑取一定数目单克隆，测序鉴定目标基因在单一克隆中的突变丰度。

本发明的有益效果是：

(1)所述利用dITP进行PCR随机引入突变的方法不需要合成多条引物，利用dI与4种正常碱基配对原则，能够实现基因各个位点的随机突变；

(2)所述利用dITP进行基因随机突变的方法，能够通过改变添加的dITP与正常dNTP的比例，来无极调控随机突变丰度；

(3)所述利用dITP进行基因随机突变的方法能够克服现有随机技术中随机突变丰度低的缺陷，能够应用于构建基因高丰度随机突变文库，增加从突变文库中获得目标突变体的概率。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图，其中：

图1是本发明的利用dITP进行基因随机突变的方法一较佳实施例的流程图。