[发明专利]一种mRNA捕获序列、捕获载体的合成方法、高通量单细胞测序文库制备方法

权利要求书

1.一种高通量单细胞测序文库制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、利用用于mRNA捕获的捕获载体的微反应单元捕获单细胞；

S2、单细胞进行裂解，释放mRNA，所述微反应单元内的mRNA捕获序列中的PoLYT与mRNA上的PolyA特异性结合，逆转录合成cDNA；

S3、置换缓冲液，加入携带复制引物的微球，进行PCR扩增反应，形成完整的cDNA双链模板，其中，所述复制引物与所述微反应单元内的mRNA捕获序列上的通用引物序列相同；

S4、回收微球并合并，清洗置换缓冲液，在cDNA双链模板末端接第一粘性末端；

S5、清洗并置换缓冲液；

S6、酶切将cDNA双链模板的第二粘性末端暴露；

S7、在S5步骤或本步骤中利用DNA连接酶连接第一测序接头；利用DNA连接酶连接第二测序接头，形成哑铃型测序文库，纯化文库；

S8、测序引物和测序酶与哑铃型测序文库组装；

S9、将组装好的文库填入纳米孔芯片中，并且锚定在纳米孔底部，上机测序；

其中，用于mRNA捕获的捕获载体的微反应单元的合成包括以下步骤：

步骤一，选择含有若干微反应单元的基底材料，通过化学修饰方法在所述微反应单元内形成若干用以接枝寡聚核苷酸的表面官能团；

步骤二，以步骤一所形成用以接枝寡聚核苷酸的表面官能团为起始点，在每一所述微反应单元内原位合成若干mRNA捕获序列，制得用于mRNA捕获的捕获载体；所述mRNA捕获序列为一条寡聚核苷酸，包括通用引物、稀有酶切位点、细胞标签、随机分子标签和PolyT序列。

2.根据权利要求1所述的一种高通量单细胞测序文库制备方法，其特征在于，所述第一粘性末端与所述第二粘性末端不同，所述第一测序接头与所述第二测序接头不同；所述微球的尺寸1～50微米；所述的PCR过程循环数为1～100。

3.根据权利要求2所述的一种高通量单细胞测序文库制备方法，其特征在于，所述微球为磁性微球，所述微球的尺寸10～30微米；所述微球的所述的PCR过程循环数为1～10。

4.根据权利要求3所述的一种高通量单细胞测序文库制备方法，其特征在于，所述第一测序接头、第二测序接头均为发卡型寡聚核苷酸；其中，

所述第一测序接头包括第一互补序列和第三粘性末端序列，所述第三粘性末端序列与cDNA双链模板末端的第一粘性末端互补；

所述第二测序接头包括第二互补序列和第四粘性末端序列，所述第四粘性末端序列与cDNA双链模板末端的第二粘性末端互补；

所述第一测序接头或所述第二测序接头包括测序引物互补序列。

5.根据权利要求1所述的一种高通量单细胞测序文库制备方法，其特征在于，所述mRNA捕获序列的结构为通用引物-稀有酶切位点-细胞标签-随机分子标签-PolyT序列，序列长度为38～180bp；其中，

所述通用引物序列用以引发cDNA双链PCR，实现cDNA链的复制，序列长度3～20bp；

所述稀有酶切位点用以由限制性内切酶特异性识别并剪切，序列长度为10～30bp，所述限制性内切酶包括AgeI、ApoI、BamHI、BbsI、BclI、BmtI、BsaI、BsiWI、BsrGI、BstEII、BstZ17I、DraIII、EagI、EcoRI、EcoRV、HindIII、KpnI、MfeI、MluI、NcoI、NheI、NotI、NruI、NsiI、PstI、PvuI、PvuII、SacI、SalI、SbfI、ScaI、SpeI、SphI、SspI、StyI；

所述细胞标签用以编码单细胞，序列长度5～50bp，以使同一细胞来源的mRNA编码相同细胞标签序列，不同细胞来源的mRNA编码不同细胞标签序列；

所述随机分子标签用以编码mRNA，序列长度10～30bp，以使每一条mRNA携带不同的分子标签序列；

PolyT序列由胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸的重复序列组成，序列长度10～50bp，用以捕获携带PolyA的mRNA。