[发明专利]一种mRNA捕获序列、捕获载体的合成方法、高通量单细胞测序文库制备方法

说明书

本发明提供了一种mRNA捕获序列，包括通用引物、稀有酶切位点、细胞标签、随机分子标签和PolyT序列，通过引入稀有酶切位点序列，为后续测序接头连接提供了粘性末端，使cDNA双链两端接上两个不同的测序接头。本发明还提供了一种用于mRNA捕获的捕获载体的合成方法及一种高通量单细胞测序文库制备方法。本发明提供的捕获载体通过在基底材料上原位合成引入稀有酶切位点序列的mRNA捕获序列，采用本发明提供的捕获载体来进行单细胞测序文库的制备，提高单细胞捕获效率以及寡核苷酸标签的标记效率，简化构建文库的流程，并且制得的cDNA双链两端接上两个不同的测序接头，保证一个哑铃型测序文库只组装一条引物及DNA聚合酶，三者的一一对应是保证单分子实时测序的前提。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种mRNA捕获序列、捕获载体的合成方法、高通量单细胞测序文库制备方法。

背景技术

肿瘤是严重影响人类健康的重大疾病之一，肿瘤细胞从基因型到表型上存在极大的差异(肿瘤的高度异质性)，而这种高度异质性与肿瘤的恶性程度、耐药性、复发转移等都密切相关，是造成肿瘤早期诊断困难、临床诊治复杂、耐药复发和预后差的根源之一。全面解析肿瘤异质性是实现肿瘤精准治疗的关键。

近年来新兴的单细胞测序技术为解析肿瘤异质性、鉴别不同功能亚群提供了可能。单细胞测序能够获得每个细胞的基因组变异图谱及转录组表达图谱，通过单个细胞的图谱精确划分克隆归属，实现对异质性克隆群体的全面解析。现有单细胞测序技术主要是单细胞捕获、编码技术与二代测序技术的组合，形成了相对成熟的单细胞转录组测序技术。Peter Van Galen等人在Cell发表文献，通过单细胞转录本与三代测序技术相结合，首次实现对白血病患者肿瘤群体(以基因组变异为金标准)中转录组异质性的解析，发现肿瘤群体存在于表达谱不同的多种谱系中，明确了基因组异质性与转录组异质性相互独立又相互影响的关系，也表明在单细胞转录组水平进一步明确细胞的基因组变异的重要性。

单细胞测序的流程主要包括单细胞捕获、单细胞编码、测序文库制备和上机测序等环节。现有的单细胞测序技术，单细胞捕获通常通过将单细胞与携带有单细胞捕获序列的磁珠同时放入微液滴或微孔中，这样的操作必须保证一个微单元内有且只有一个单细胞和一个编码磁珠，然而现有技术单细胞和磁珠在微单元内的分布遵循泊松分布，能够满足需求的微单元数量小于10％，微单元利用率低，限制了该方法的单细胞处理通量。现有单细胞捕获也可以通过将捕获序列偶联在微孔上，再将单细胞放入微孔内，现有技术通过将预先合成的寡核苷酸序列，通过点样的方式加入目标微孔中，依次接枝偶联。因为每个微孔内的序列都不相同，在进行高通量分析时，需要的寡核苷酸序列库和点样接枝的工作量极为庞大，现有技术难以实现万级以上微孔的修饰工作，因此检测通量受到极大限制。此外，现有的单细胞测序技术通常两端连接同样的测序接头，很难实现在cDNA双链模板两端连接两个不同的测序接头。因此，如何提高单细胞测序技术中单细胞捕获的准确性和通量、如何使cDNA双链模板两端连接两个不同的测序接头为本领域面临的一技术难题。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的一个目的是提供一种mRNA捕获序列，引入稀有酶切位点序列，为后续测序接头连接提供了粘性末端，进而使cDNA双链两端接上两个不同的测序接头，可以保证一个哑铃型测序文库只组装一条引物及DNA聚合酶，三者的一一对应是保证单分子实时测序的前提。

本发明的第一个目的是提供一种mRNA捕获序列，所述mRNA捕获序列为一条寡聚核苷酸，包括通用引物、稀有酶切位点、细胞标签、随机分子标签和PolyT序列。

优选地，所述mRNA捕获序列的结构为通用引物-稀有酶切位点-细胞标签-随机分子标签-PolyT序列，序列长度为38～180bp；其中，

所述通用引物序列用以引发cDNA双链PCR，实现cDNA链的复制，序列长度3～20bp；