[发明专利]一种适冷性海带淀粉酶及其应用

权利要求书

1.一种适冷性海带淀粉酶的应用，其特征在于：海带淀粉酶Lam16A_Wa，其氨基酸序列为SEQ ID NO. 1；所述海带淀粉酶Lam16A_Wa的最适反应温度为35℃，在室温下仍能保持80%以上的活力；最适反应pH值为6.0，且在pH 3.0-11.0的pH值范围内基本保持稳定，酶动力学常数Km为1.29mg/mL， Kcat为111.89 s-1，Vmax为203.01 U/mg；应用在海带淀粉定量检测中。

2.一种海带淀粉的定量检测方法，其特征在于：采用权力要求1中所述的海带淀粉酶Lam16A_Wa与样品反应，测定400-420nm处的吸光值。

3.如权利要求2所述的海带淀粉的定量检测方法，其特征在于：检测时采用对羟基苯甲酰肼（pHBH）作为显色剂。

4.如权利要求3所述的海带淀粉的定量检测方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）海带淀粉溶液的配制：称取化学级或以上纯度的海带淀粉溶于缓冲液，制备具有浓度梯度的海带淀粉标准溶液；

（2）pHBH溶液的配制：称取pHBH溶于HCl中，然后加入NaOH调溶液pH至碱性，制备成pHBH溶液。

（3）定量标准曲线的绘制：取步骤（1）配制的不同浓度海带淀粉溶液分别与适量的Lam16A_Wa酶液混合进行反应，酶的添加量为5-20μL，反应时间为10-30min，反应温度为20-50℃；反应后于100℃金属浴放置5-10min使酶灭活；再加入pHBH溶液，于100℃金属浴中显色5-10min，迅速冷却至室温后离心取上清液，测定上清液的吸光值，检测波长为400-420nm；将相同浓度梯度的海带淀粉溶液与灭活酶液混合重复上述反应，测定其吸光值作为对照，然后计算出不同浓度海带淀粉溶液所对应的吸光值增量；以海带淀粉标准溶液浓度为横坐标，以各浓度海带淀粉的吸光值增量为纵坐标，通过线性拟合得出特定反应条件下的标准曲线；

（4）样品测定：向样品中加入一定量Lam16A_Wa重复步骤（3）的反应；将吸光值增量代入相应加酶量、反应时间、反应温度、反应pH等条件下的标准曲线，计算出反应体系中的海带淀粉浓度，进而可得到样品中的海带淀粉含量。

5.如权利要求4所述的海带淀粉的定量检测方法，其特征在于：步骤（1）中的缓冲液pH为7.0-11.0。

6.如权利要求4所述的海带淀粉的定量检测方法，其特征在于：步骤（4）测定前按照国标GB5009.88—2014方法，除去样品中的还原糖。