[发明专利]基于哑铃环模板的恒温滚环扩增方法

说明书

本发明属于核酸扩增技术领域，具体涉及一种基于哑铃环模板的恒温滚环扩增方法，包括如下步骤：(1)制备哑铃环状DNA作为模板，所述哑铃环状DNA整体对称，两端为大小相等的环部区域，中间为完全互补的茎部区域；(2)将步骤(1)制备得到的模板加入到反应体系中进行超分支滚环扩增反应，反应得到的扩增产物自身形成二级结构。该基于哑铃环模板的恒温滚环扩增方法操作简单，在恒温条件下即可实现核酸扩增反应，在避免非特异性扩增的同时保证其高效扩增，提高扩增效率。

技术领域

本发明属于核酸扩增技术领域，具体涉及一种基于哑铃环模板的恒温滚环扩增方法。

背景技术

滚环扩增技术(RCA)起源于上世纪九十年代，最初是使用单个引物进行扩增的线性滚环扩增方法(LRCA)，随后发展出了使用一对引物的超分支滚环扩增方法(HRCA)，以及在HRCA基础上引入切刻内切酶的PG-RCA、NRCA等扩增技术。发展至今，RCA已经成为最常用的等温扩增技术之一，其应用领域涉及药学、微生物检测、临床医学等。同样作为等温扩增技术，RCA在批量检测、现场检测方面比PCR更具有优势，在食品领域也有较高的应用价值，例如可通过RCA扩增食品内标物，建立食品溯源相关的检测技术等。

相较于LRCA技术而言，HRCA扩增效率更快、灵敏度更高，广泛应用于各检测技术及纳米领域中。但是，目前在使用HRCA扩增方法进行扩增时，很容易产生非特异性扩增或者发生扩增产物彼此互补的现象；非特异性扩增易产生和滚环扩增类似的假阳性结果，给检测带来极大的不便；而扩增产物彼此互补，会使引物难以结合到模板上进行指数扩增，导致扩增效率降低。出现上述问题是因为常规HRCA所用模板通常为二级结构极少的单环，其扩增产物单链部分刚性较弱，因此很容易彼此缠绕结合形成稳定的DNA双螺旋，占据引物结合位点，使游离的引物难以结合到扩增产物上，从而降低扩增效率。

因此，急需建立一种更高效的超分支滚环扩增方法，在避免非特异性扩增的同时保证其扩增效率，如果能通过改变模板二级结构，获得单链刚性较强不易彼此结合且保留引物结合位点的扩增产物，将能够极大提高HRCA的扩增效率。

发明内容

针对现有的HRCA扩增产物彼此结合占据引物结合位点的问题，本发明提出了一种基于哑铃环模板的恒温滚环扩增方法，为二代超分支滚环扩增方法，设计了一种新型哑铃环模板，利用哑铃环模板解决HRCA扩增时的自身产物互补的问题，在扩增模板内部引入发夹结构，环区部分的单链用于结合引物；该模板的扩增产物自身形成重复的茎环结构，保留了引物结合位点，从而在避免非特异性扩增的同时保证其扩增效率。

本发明的技术方案是：

基于哑铃环模板的恒温滚环扩增方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)制备哑铃环状DNA作为模板，所述哑铃环状DNA整体对称，两端为大小相等的环部区域，中间为完全互补的茎部区域；

(2)将步骤(1)制备得到的模板加入到反应体系中进行超分支滚环扩增反应，反应得到的扩增产物自身形成二级结构；扩增产物自身形成的二级结构降低与其他互补产物结合的可能，为引物结合保留位点，从而实现高效扩增。

上述恒温扩增方法的作用原理及过程如下：

在环形模板自身内部设计了互补序列，使两端形成大小相等的单链环部区域以结合引物，相比于常规HRCA，这种二级结构的设计会使结合引物的区域变为较小的环，导致环的刚性变强，对扩增刚开始时的引物结合存在一定阻碍；

当第一条引物结合之后，随着扩增的进行，模板本身的二级结构被打开，开始和常规扩增一样生成串联重复的模板互补序列；

随后，其扩增产物中也存在互补部分并会优先形成自身的茎环结构，降低与其他扩增产物互补的几率；