[发明专利]一种液质联用同时测定人血浆中内源性皮质醇、皮质酯酮、雄烯二酮、睾酮浓度的方法

权利要求书

1.一种液质联用同时测定人血浆中内源性皮质醇、皮质酯酮、雄烯二酮、睾酮浓度的方法，其特征在于，该方法包括：

(1)替代基质的选择：选择3％BSA生理盐水溶液作为代替基质进行人血浆中皮质醇、皮质酯酮、雄烯二酮、睾酮的方法学验证试验及样品分析试验；

(2)对人血浆中内源性皮质醇、皮质酯酮、雄烯二酮、睾酮浓度的确定：用所述步骤(1)确定的替代基质进行标准曲线样品的配制，然后对所用到的各批次的人血浆中的本底皮质醇、皮质酯酮、雄烯二酮、睾酮的浓度进行测定，确定混合后的对照基质中皮质醇、皮质酯酮、雄烯二酮、睾酮的平均浓度分别为79.6ng/mL、1.94ng/mL、1.06ng/mL、1.70ng/mL，用以计算实际的质控样品的理论浓度；

(3)标准曲线样品的制备及前处理：包括内容溶液的配制、标准系列溶液的配制、工作曲线样品的前处理，其中，

内标溶液的配制为取地塞米松标准品，经质量校正因子校正后，将其溶于甲醇中，得到最终浓度为1.00mg/mL的储备液；再用50％甲醇水溶液稀释成为200ng/mL的内标工作液；

标准系列溶液的配制为分别取皮质醇、皮质酯酮、雄烯二酮、睾酮标准品适量，用甲醇配制成浓度为1.00mg/mL的储备液；再用50％甲醇水稀释成为皮质酯酮、雄烯二酮、睾酮浓度为4.00、8.00、40.0、200、400、1200、1800、2000ng/mL和皮质醇浓度为160、320、800、2400、4800、9600、14400、16000ng/mL的系列工作液；然后将上述两套工作液按对应的浓度点进行等体积混合，最后得到配制标准曲线样品所需的标准曲线工作液，其中皮质酯酮、雄烯二酮、睾酮浓度为2.00、4.00、20.0、100、200、600、900和1000ng/mL；皮质醇浓度为80.0、160、400、1200、2400、4800、7200和8000ng/mL；

工作曲线样品的前处理为向285μL的替代基质中分别加入15.0μL的上述本步骤中用于标准曲线配制的系列工作溶液，配制成相当于皮质酯酮、雄烯二酮、睾酮浓度为0.100ng/mL、0.200ng/mL、1.00ng/mL、5.00ng/mL、10.0ng/mL、30.0ng/mL、45.0ng/mL、50.0ng/mL和皮质醇浓度为4.00ng/mL、8.00ng/mL、20.0ng/mL、60.0ng/mL、120ng/mL、240ng/mL、360ng/mL、400ng/mL的样品，分装出2份，每份100μL；每份加入15.0μL的内标工作液，再加入400μL的乙酸乙酯进行萃取，离心后取200μL上清液，再氮气下吹干，加入150μL的50％甲醇水溶液复溶，震荡离心后，供LC-MS/MS测定；

(4)质控样品的制备及前处理：包括标准系列溶液的配制、质控样品的前处理，其中，

标准系列溶液的配制为分别取皮质醇、皮质酯酮、雄烯二酮、睾酮标准品适量，分别用甲醇配制成浓度为1.00mg/mL的储备液；再用50％甲醇水稀释成为含皮质酯酮、雄烯二酮、睾酮浓度为1600ng/mL的W1-HQC、800ng/mL的W1-MQC、80.0ng/mL的W1-GMQC1、40.0ng/mL的W1-GMQC2、12.0ng/mL的W1-LQC和皮质醇浓度为10000ng/mL的W2-HQC、6000ng/mL的W2-MQC、2000ng/mL的W2-GMQC、480ng/mL的W2-LQC的系列工作液；然后将上述两套工作液按对应的浓度点进行等体积混合，最后得到配制标准曲线样品所需的质控工作液：高浓度质控工作液W-HQC为W1-HQC与W2-HQC混合，皮质酯酮、雄烯二酮、睾酮浓度为800ng/mL，皮质醇浓度为5000ng/mL；中浓度质控工作液W-MQC为W1-MQC与W2-MQC混合，皮质酯酮、雄烯二酮、睾酮浓度为400ng/mL，皮质醇浓度为3000ng/mL；几何中浓度质控工作液W-GMQC为W1-GMQC1与W2-GMQC混合，皮质酯酮、雄烯二酮、睾酮浓度为40.0ng/mL，皮质醇浓度为1000ng/mL；低浓度质控工作液W-LQC为W1-LQC与W2-LQC混合，皮质酯酮、雄烯二酮、睾酮浓度为6.00ng/mL，皮质醇浓度为240ng/mL；

质控样品的前处理：分别向665μL人空白血浆中加入35.0μL上述W1-GMQC2工作液、W-MQC工作液和W-HQC工作液，配制相对应的GMQC质控样品、MQC质控样品、HQC质控样品；取一定体积人血浆，再用替代基质分别稀释至接近低质控浓度和定量下限浓度，配制为LQC和LLOQ质控样品，每个质控样品分装出6份，每份100μL；每份加入15.0μL的内标工作液，再加入400μL的乙酸乙酯进行萃取，离心后取200μL上清液，再氮气下吹干，加入150μL的50％甲醇水溶液复溶，震荡离心后，供LC-MS/MS测定；

(5)采用内标法，以系列皮质醇、皮质酯酮、雄烯二酮、睾酮在替代基质中的浓度为横坐标，皮质醇、皮质酯酮、雄烯二酮、睾酮分别与内标地塞米松的峰面积比为纵坐标，进行线性回归运算，权重因子为1/x2，得到线性回归方程，即为工作曲线，使用工作曲线，分别对人血浆中内源性皮质醇、皮质酯酮、雄烯二酮、睾酮的浓度进行测定。

2.根据权利要求1所述的一种液质联用同时测定人血浆中内源性皮质醇、皮质酯酮、雄烯二酮、睾酮浓度的方法，其特征在于，所述LC-MS/MS测定条件包括：

液相色谱条件：

色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18 1.7μm，50x 2.1mm；

流动相：A＝0.1％甲酸水溶液，溶液含2％甲醇；B＝0.1％甲酸甲醇溶液，溶液含5％水，梯度如下：

0-0.60min，流动相A为70.0％，流动相B为30.0％；0.60-1.50min，流动相A从70.0％到40.0％，流动相B从30.0％到60.0％；1.50-3.80min，流动相A从40.0％到30.0％，流动相B从60.0％到70.0％；3.80-4.00min，流动相A从30.0％到0％，流动相B从70.0％到100％；4.00-4.30min，流动相A保持为0％，流动相B保持为100％；4.30-4.40min，流动相A从0％到70.0％，流动相B从100％到30.0％；4.40-5.00min，流动相A保持为70.0％，流动相B保持为30.0％；

流速：0.500mL/min；

柱温：40；℃

进样量：10.0μL；

质谱检测器及条件：质谱检测器为Triple Quad 6500+,AB Sciex；离子源为电喷雾离子源；喷雾电压为5500V；离子源温度：550；℃帘气CUR：20psi，碰撞气CAD：9psi，GS1：50psi，GS2：20psi；正离子方式检测；扫描方式：MRM；雄烯二酮定量离子对为287.2→97.1，碰撞电压为28.0eV；睾酮定量离子对为289.2→109.1，碰撞电压为31.0eV；皮质酮定量离子对为347.2→293.1，碰撞电压为25.0eV；皮质醇定量离子对为363.2→327.3，碰撞电压为23.0eV；内标地塞米松定量离子对为393.1→373.3，碰撞电压为13.0eV。