[发明专利]一种液质联用同时测定人血浆中内源性皮质醇、皮质酯酮、雄烯二酮、睾酮浓度的方法

说明书

本发明目的在于提供一种可以同时准确测定人血浆中内源性皮质醇、皮质酯酮、雄烯二酮、睾酮浓度的方法。所述方法包括：(1)替代基质的选择；(2)对照基质中内源性皮质醇、皮质酯酮、雄烯二酮、睾酮浓度的确定(3)工作曲线样品的制备及前处理；(4)质控样品的制备及前处理；(5)分离分析条件；(6)采用内标法，以系列皮质醇、皮质酯酮、雄烯二酮、睾酮在替代基质中的浓度为横坐标，皮质醇、皮质酯酮、雄烯二酮、睾酮分别与内标地塞米松的峰面积比为纵坐标，通过使用权重因子1/x2，线性回归得到理论浓度与响应之间的线性关系进行定量。

技术领域

本发明属于医药检测技术领域，特别涉及一种测定人血浆中内源性皮质醇、皮质酯酮、雄烯二酮、睾酮浓度的方法。

背景技术

性激素是主要的甾体类激素，是一类脂溶性小分子激素，由胆固醇经一系列酶催化而来，是身体发育、性成熟及新陈代谢所必须的，在维持各项生命活动、调节机体物质代谢等方面发挥重要作用(参考文献：1.Andreu Fabregat,Aristotelis Kotronoulas,JosepMarcos,et al.Detection,synthesis and characterization of metabolites ofsteroid hormones conjugated with cysteine.Steroids,2013,78:327-336.)。临床上常通过性激素水平来了解妇科内分泌及相关生殖疾病，异常子宫出血、闭经、不孕症、妇科相关肿瘤等，因此，性激素不仅可作为治疗药物进行研究，还可以作为此类抗肿瘤药物治疗效果的生物标志物进行研究。但是，性激素作为内源性物质，能否准确定量是检测的难点。本发明基于替代基质法，建立了一种科学、快速和准确的液质联用测定人血浆中内源性皮质醇、皮质酯酮、雄烯二酮、睾酮浓度的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种液质联用同时测定人血浆中内源性皮质醇、皮质酯酮、雄烯二酮、睾酮浓度的方法，本发明所述的方法可以用于准确、简便和快速地评价患者治疗的体内药效。

为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：

(1)替代基质的选择

本发明使用“相对加标回收率”法，来筛选合适的替代基质。以生理盐水配制3％BSA溶液考察替代基质的加标回收率；用475μL代替基质/对照基质加入25.0μL稀释剂/W-GMQC/W-MQC/W-HQC工作液，混合均匀后，各分装4份100μL；每份加入15.0μL的内标工作液，再加入400μL的乙酸乙酯进行萃取，离心后取200μL上清液，再氮气下吹干，加入150μL的50％甲醇水溶液复溶，震荡离心后，供LC-MS/MS测定。结果代入相对加标回收率进行计算，相对加标回收率接受标准：三个浓度的相对加标回收率在85％～115％之间，且％CV不超过15％。计算公式如下：

％相对加标回收率＝(spiked SM–blank SM)/(spiked SM–blank SM)

spiked SM＝加标代替基质中分析物与内标的峰面积比值

blank SM＝空白代替基质中分析物与内标的峰面积比值

spiked CM＝加标对照基质中分析物与内标的峰面积比值

spiked CM＝空白对照基质中分析物与内标的峰面积比值

结果发现内标地塞米松和皮质醇、皮质酯酮、雄烯二酮、睾酮在3％BSA生理盐水溶液与人血浆样品中的质谱响应基本趋于一致，三个浓度的相对加标回收率在90％-115％之间，且变异系数均不超过15％。故选择3％BSA生理盐水溶液作为代替基质进行人血浆中皮质醇、皮质酯酮、雄烯二酮、睾酮的方法学验证试验及样品分析试验。

(2)对照基质(人血浆)中内源性皮质醇、皮质酯酮、雄烯二酮、睾酮浓度的确定