[发明专利]检测CYP21A2基因突变的方法、引物和试剂盒

说明书

本发明公开了检测先天性肾上腺皮质增生症相关的CYP21A2基因突变的方法、引物和试剂盒，所述引物、试剂盒均包括针对CYP21A2基因全外显子的扩增引物和测序引物。基于PCR扩增和Sanger测序，本发明可快速地检测先天性肾上腺皮质增生症相关的CYP21A2基因突变位点的突变情况。

技术领域

本发明属生命科学和生物技术领域，特别涉及检测先天性肾上腺皮质增生症相关的CYP21A2基因突变的方法、引物和试剂盒。

背景技术

先天性肾上腺皮质增生症(CAH)是一组由肾上腺皮质激素合成过程中酶的缺陷所引起的常染色体隐性遗传性疾病。根据酶缺乏成都CAH可以分为失盐型CAH、单纯男性化型CAH、非典型性CAH，前两者统称为典型CAH。该病的发病率较低，新生儿CAH的发病率约为1/16000～1/20000，典型的CAH发病率约为1/10000，非典型CAH的发病率约为典型的10倍，且女性多于男性。而21羟化酶缺陷症(21OHD)是其中最常见的类型，约占90％～95％，21OHD在新生儿中的发病率约为1/15000～1/18000。

人体中编码21羟化酶的基因CYP21A2定位于6p21.3的HLAⅢ区域，具有10个外显子和9个内含子，该基因与不具有活性的假基因(CYP21P)串联排列在C4A和C4B基因的3’端，两者相距30Kb，而且外显子和内含子的同源性分别为98％和95％。这种高度的同源性造成检测CYP21A2突变较为困难，因此通过qPCR技术，无法应用于复杂重排的检测，难以广泛开展。其他的诸如Southern杂交技术、等位基因特异性聚合酶链反应、等位基因特异性寡核苷酸探针、RFLP等都存在繁琐、耗时耗力或无法检测所有突变类型等，都无法使用这些方法检测基因CYP21A2的突变。所以目前最好的方法就是对CYP21A2基因进行直接测序，可以快速准确诊断出患者的病情。目前该病在中国人群的常见的突变是IVS2-13A/C>G、R356W、I172N和E3Δ8bp等。

发明内容

本发明采用Sanger测序法检测先天性肾上腺皮质增生症相关的CYP21A2基因突变，并且设计的引物分别扩增包含基因CYP21A2全外显子上的DNA片段，通过测序结果的分析，可以很直观地了解先天性肾上腺皮质增生症相关的CYP21A2基因突变位点的突变情况，扩增引物设计时加上了M13接头，并使用M13作为测序引物，简化操作步骤和节约了检测成本。

本发明提供了检测CYP21A2基因突变的引物，其特征在于，包括至少一对用于扩增CYP21A2基因的扩增引物和一对测序引物M13F和M13R，所述扩增引物选自自CYP21A2-1_2F/CYP21A2-1_2R，CYP21A2-3_6F/CYP21A2-3_6R，CYP21A2-7_9F/CYP21A2-7_9R，CYP21A2-10F/CYP21A2-10R；，其碱基序列为：

CYP21A2-1_2F：TGATGTGGAACCAGAAAGCTGTAAAACGACGGCCAGT

CYP21A2-1_2R：GGGCAGCATAGCAAGAACAACAGCTATGACCATG；

CYP21A2-3_6F：TCCCACCTCAGCCTCAAGTTGTAAAACGACGGCCAGT

CYP21A2-3_6R：ACCCGCCTCATAGCAATGAACAGCTATGACCATG；

CYP21A2-7_9F：ACAGCCAGTGATGCTACCGTGTAAAACGACGGCCAGT

CYP21A2-7_9R：ACCAGCCTCCACCACATTTAACAGCTATGACCATG；

CYP21A2-10F：ACAGTCATCATTCCGAACCTTGTAAAACGACGGCCAGT