[发明专利]治疗移植排斥反应的嵌合受体重组基因的构建方法及应用

权利要求书

1.治疗移植排斥反应的嵌合受体重组基因的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

提取患者体内的T细胞，并根据供体特异性HLA分子利用基因编辑技术将CAR嵌合抗体编辑到所述T细胞内，制备CAR-T细胞；

根据预设培养条件对所述CAR-T细胞进行体外培养，并筛选出编辑成功的所述CAR-T细胞，进行提纯；

采用预设方法构建PD1和CTLA4点突变质粒，并将所述PD1和CTLA4点突变质粒的序列导入逆转录病毒中，进行包装浓缩，制备目的蛋白；

通过预设方法向所述CAR-T细胞中导入所述目的蛋白并激活，再筛选出导入成功的目的细胞，进行刺激、扩增制备细胞制剂，得到CAR-Treg军团；

将培养好的所述CAR-Treg军团输回患者体内。

2.根据权利要求1所述的治疗移植排斥反应的嵌合受体重组基因的构建方法，其特征在于，所述提取患者体内的T细胞，并根据供体特异性HLA分子利用基因编辑技术将CAR嵌合抗体编辑到所述T细胞内，制备CAR-T细胞具体包括以下步骤：

对所述T细胞进行分离处理，并将分离的CD3、CD8和T细胞激活后培养扩增；

使用携带CAR的重组慢病毒感染处理后的所述T细胞，制得CAR-T细胞。

3.根据权利要求2所述的治疗移植排斥反应的嵌合受体重组基因的构建方法，其特征在于，所述提取患者体内的T细胞，并根据供体特异性HLA分子利用基因编辑技术将CAR嵌合抗体编辑到所述T细胞内，制备CAR-T细胞还包括以下步骤：

获取患者血压样本；

采用离心法对所述血液样本进行离心处理，获取所述血液样本中的单个核细胞；

对所述单个核细胞进行分选获取所述T细胞。

4.根据权利要求1所述的治疗移植排斥反应的嵌合受体重组基因的构建方法，其特征在于，所述预设培养条件为：恒温37℃，CO₂浓度5％，相对饱和湿度95％，细胞培养基PH值7.2-7.4。

5.根据权利要求1所述的治疗移植排斥反应的嵌合受体重组基因的构建方法，其特征在于，所述采用预设方法构建PD1和CTLA4点突变质粒，并将所述PD1和CTLA4点突变质粒的序列导入逆转录病毒中，进行包装浓缩，制备目的蛋白具体包括以下步骤：

以待突变的PD1和CTLA4质粒为模板，使用突变引物及Muta-directTM酶进行PCR扩增反应，诱导目的基因突变，获取突变质粒DNA；

在所述PCR扩增反应结束后使用MutazymeTM酶消化甲基化质粒，并选择突变质粒DNA；

将反应后的所述突变质粒DNA导入大肠杆菌感受态细胞中进行转化，获取PD1和CTLA4点突变质粒；

将所述PD1和CTLA4点突变质粒的序列导入逆转录病毒中进行逆转录，并进行包装浓缩，获取目的蛋白。

6.根据权利要求5所述的治疗移植排斥反应的嵌合受体重组基因的构建方法，其特征在于，所述突变引物的设计原则包括：

使用经过钝化的突变引物，且所述突变引物的长度为30-35bp，以要突变的碱基为中心，两边各加上至少11-12bp的突变引物，并且合成多一条反向互补的突变引物；

根据设定所述突变引物的长度，计算所述突变引物的Tm值，并确保所述Tm值达到78℃。

7.根据权利要求5所述的治疗移植排斥反应的嵌合受体重组基因的构建方法，其特征在于，在所述PCR扩增反应完成后需要冰育5min，然后置于室温中。