[发明专利]治疗移植排斥反应的嵌合受体重组基因的构建方法及应用

说明书

本发明公开了治疗移植排斥反应的嵌合受体重组基因的构建方法，包括以下步骤：提取患者体内的T细胞，并根据供体特异性HLA分子利用基因编辑技术将CAR嵌合抗体编辑到T细胞内，制备CAR‑T细胞；对CAR‑T细胞进行体外培养，并筛选出编辑成功的CAR‑T细胞，进行提纯；构建PD1和CTLA4点突变质粒，并将PD1和CTLA4点突变质粒的序列导入逆转录病毒中，进行包装浓缩，制备目的蛋白；向CAR‑T细胞中导入目的蛋白并激活，再筛选出导入成功的目的细胞，进行刺激、扩增制备细胞制剂，得到CAR‑Treg军团；将培养好的CAR‑Treg军团输回患者体内。有益效果：可以抑制细胞免疫，预防急性排斥反应的发生，同时有助于预防固有免疫介导的慢性排斥反应。

技术领域

本发明涉及用于移植术后对于急慢性排斥反应的预防和治疗领域，具体来说，涉及治疗移植排斥反应的嵌合受体重组基因的构建方法及应用。

背景技术

目前移植手术愈发成为各脏器终末期疾病的治疗手段，移植手术逐步常规化、大众化。但是慢性排斥反应一直是制约移植物长期存活的限制。

其中，CAR-T疗法是利用患者自身免疫细胞杀伤肿瘤细胞，是一种特异性杀伤肿瘤细胞的方法。与传统免疫疗法相比，CAR-T疗法在体外和临床试验中均已表现出了更好的靶向性和杀伤性，展示了巨大的应用潜力和发展前景。

目前CAR-T技术在移植免疫应用主要有两个方向，1、将病人T细胞分离，诱导制备Treg亚群(抑制性T细胞)回输，目前处于临床实验阶段；2、将Treg细胞通过基于CAR-T技术编辑，使Treg细胞识别抗原能力增强，大量聚集于抗原周围，在局部发挥免疫移植功能。但是，目前临床试验仅处于增加Treg细胞亚群比例和局部浸润比例，对于Treg的功能增强未有较好的临床方案。

发明内容

(一)解决的技术问题

针对现有技术的不足，本发明提供了治疗移植排斥反应的嵌合受体重组基因的构建方法及应用，具备预防固有免疫介导的慢性排斥反应和预防急性排斥反应发生的优点，进而解决背景技术中的问题。

(二)技术方案

为实现上述具备预防固有免疫介导的慢性排斥反应和预防急性排斥反应发生的优点，本发明采用的具体技术方案如下：

根据本发明的一个方面，提供了治疗移植排斥反应的嵌合受体重组基因的构建方法，包括以下步骤：

提取患者体内的T细胞，并根据供体特异性HLA分子利用基因编辑技术将CAR嵌合抗体编辑到所述T细胞内，制备CAR-T细胞；

根据预设培养条件对所述CAR-T细胞进行体外培养，并筛选出编辑成功的所述CAR-T细胞，进行提纯；

采用预设方法构建PD1和CTLA4点突变质粒，并将所述PD1和CTLA4点突变质粒的序列导入逆转录病毒中，进行包装浓缩，制备目的蛋白；

通过预设方法向所述CAR-T细胞中导入所述目的蛋白并激活，再筛选出导入成功的目的细胞，进行刺激、扩增制备细胞制剂，得到CAR-Treg军团；

将培养好的所述CAR-Treg军团输回患者体内。

进一步的，所述提取患者体内的T细胞，并根据供体特异性HLA分子利用基因编辑技术将CAR嵌合抗体编辑到所述T细胞内，制备CAR-T细胞具体包括以下步骤：

对所述T细胞进行分离处理，并将分离的CD3、CD8和T细胞激活后培养扩增；

使用携带CAR的重组慢病毒感染处理后的所述T细胞，制得CAR-T细胞。

进一步的，所述提取患者体内的T细胞，并根据供体特异性HLA分子利用基因编辑技术将CAR嵌合抗体编辑到所述T细胞内，制备CAR-T细胞还包括以下步骤：