[发明专利]一种生产β-石竹烯的工程菌及其构建方法与应用

权利要求书

1.一种生产β-石竹烯的工程菌，其特征在于，所述工程菌过表达乙酰辅酶A酰基转移酶/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因mvaE、3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶基因mvaS、甲羟戊酸激酶基因ERG12、甲羟戊酸-5-磷酸激酶基因ERG8、甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶基因ERG19、异戊烯焦磷酸异构酶基因IDI1、牻牛儿基焦磷酸合成酶基因GPPS2、法尼基焦磷酸合成酶基因ispA和β-石竹烯合成酶基因NtCAS；宿主菌为大肠杆菌；所述β-石竹烯合成酶基因NtCAS的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的工程菌，其特征在于，所述乙酰辅酶A酰基转移酶/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因mvaE来源于粪肠球菌(Enterococcus faecalis)，GenBankNo.AAG02438；所述3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶基因mvaS来源于粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)，GenBank No.AAG02439；所述甲羟戊酸激酶基因ERG12来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，GenBank No.NM_001182715.1；所述甲羟戊酸-5-磷酸激酶基因ERG8来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，GenBank NO.NM_001182727.1；所述甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶基因ERG19来源于酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，GenBank NO.X97557.1，所述异戊烯焦磷酸异构酶基因IDI1来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，GenBank NO.NM_001183931.1；所述牻牛儿基焦磷酸合成酶基因GPPS2来源于北美冷杉(Abies grandis)，GenBank No.AF513112.1，所述法尼基焦磷酸合成酶基因ispA来源于大肠杆菌(Escherichia coli)，GenBank No.AM946981.2；所述β-石竹烯合成酶基因NtCAS来源于烟草，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.权利要求1-2任意一项所述的工程菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)克隆烟草β-石竹烯合成酶基因NtCAS；

(2)表达载体的构建：将乙酰辅酶A酰基转移酶基因/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因mvaE，3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶基因mvaS，牻牛儿基焦磷酸合成酶基因GPPS2，法尼基焦磷酸合成酶基因ispA和步骤(1)克隆的β-石竹烯合成酶基因NtCAS连接到载体上，得到重组质粒pmiNtCAS；

(3)重组菌转化：将pYJM14质粒与步骤(2)所得重组质粒pmiNtCAS转化大肠杆菌，得到用于生产β-石竹烯的工程菌。

4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)具体为：提取烟草叶片组织的RNA，采用逆转录酶将RNA转化为cDNA模板，以逆转录反应得到的cDNA为模板，正向引物为：5'-ATGGATTTGAGCAAAGGCTTGCCGGT-3'，反向引物为：5'-TTATGGAACAGGATCAACCAATATTG-3'，进行PCR扩增，获得目的基因NtCAS。