[发明专利]一种生产β-石竹烯的工程菌及其构建方法与应用

说明书

一种生产β‑石竹烯的工程菌及构建方法与应用，属于生物工程技术领域。为了提高β‑石竹烯生物合成的效率，本发明提供了用于生产β‑石竹烯工程菌及其构建方法与应用，包括如下步骤：向能够产生法尼基焦磷酸的受体菌株中导入从烟草中克隆的β‑石竹烯合成酶的编码基因，得到重组菌；从所述重组菌中获得所述用于生产β‑石竹烯的工程菌。本发明成功运用生物工程技术实现了β‑石竹烯生物合成途径的异源重建及产物的联产，摇瓶发酵法β‑石竹烯产量达到25.06mg/L；通过重组菌株在发酵罐中的高密度发酵技术，β‑石竹烯产量提高约85倍。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及一种生产β-石竹烯的工程菌及其构建方法与应用。

技术背景

β-石竹烯(又称β-丁香油精，学名是反-(1R,9S)-8-亚甲基-4,11,11-四甲基双环[7.2.0]十一-4-烯，β-caryophyllen)是一种双环倍半萜类化合物，天然存在于柠檬、园柚、肉豆蔻、胡椒、覆盆子、黑加仑、肉桂叶油、丁香叶油中，是肉桂油、丁香油等的主要成分之一。石竹烯具有辛香、木香、柑橘香、樟脑香，温和的丁香香气，因此可以用于调配食用香精，也可以用来合成乙酰基石竹烯等其他更有价值的香料。同时石竹烯也具有一定的药理价值，先前的研究表明石竹烯具有抗癌、消炎、抗菌等生物活性。

石竹烯可以从天然产物中提取获得，主要通过真空分馏已经去除丁香酚的丁香油；石竹烯也可以通过化学方法合成获得，以十二烷为底物，在磷钨酸或PW/SiO₂为催化剂，在酸性条件下剧烈搅拌，在一定温度下反应，最后分离获得石竹烯。也可以(+)-六氢-3a-羟基-7a-甲基-1H-茚-1,5(6H)-二酮为原料，经过还原、脱水、碱重排、羟基缩合等反应生成石竹烯。但是化学合成需要在强酸强碱条件下进行，同时存在合成效率底下，条件复杂等缺点，且化学合成产物“非天然”，作为食品添加剂，消费者的认可度低，影响了产品的下游应用。

发明内容

为了提高β-石竹烯生物合成的效率，本发明通过在能够产生法尼基焦磷酸的大肠杆菌宿主菌中表达烟草来源的β-石竹烯合成酶NtCAS构建了一种生产β-石竹烯的工程菌，用于β-石竹烯的合成。技术方案如下：

第一，本发明提供了一种生产β-石竹烯的工程菌，所述工程菌过表达乙酰辅酶A酰基转移酶/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因mvaE、3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶基因mvaS、甲羟戊酸激酶基因ERG12、甲羟戊酸-5-磷酸激酶基因ERG8、甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶基因ERG19、异戊烯焦磷酸异构酶基因IDI1、牻牛儿基焦磷酸合成酶基因GPPS2、法尼基焦磷酸合成酶基因ispA和β-石竹烯合成酶基因NtCAS；宿主菌为大肠杆菌。

进一步地限定，所述乙酰辅酶A酰基转移酶/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因mvaE来源于粪肠球菌(Enterococcus faecalis)，GenBank No.AAG02438；所述3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶基因mvaS来源于粪肠球菌(Enterococcus faecalis)，GenBank No.AAG02439；所述甲羟戊酸激酶基因ERG12来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，GenBankNo.NM_001182715.1；所述甲羟戊酸-5-磷酸激酶基因ERG8来源于酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，GenBank NO.NM_001182727.1；所述甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶基因ERG19来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，GenBank NO.X97557.1，所述异戊烯焦磷酸异构酶基因IDI1来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，GenBank NO.NM_001183931.1；所述牻牛儿基焦磷酸合成酶基因GPPS2来源于北美冷杉(Abies grandis)，GenBank No.AF513112.1，所述法尼基焦磷酸合成酶基因ispA来源于大肠杆菌(Escherichia coli)，GenBank No.AM946981.2；所述β-石竹烯合成酶基因NtCAS来源于烟草，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。