[发明专利]基因表达盒及其在Cre-lox重组效率检测中的应用

说明书

本发明涉及分子生物学领域，具体而言，涉及一种基因表达盒及其在Cre‑lox重组效率检测中的应用。该基因表达盒包括顺次连接的第一启动子、第一lox位点、报告元件、第二lox位点、目的基因以及第三终止子；其中，所述第一lox位点和第二lox位点是同向的；所述报告元件顺次包括第二启动子、第二终止子以及报告基因，且所述第二启动子、所述第二终止子以及所述报告基因是原位反向插入所述基因表达盒中的；所述报告元件还包括第一终止子，所述第一终止子位于所述第二启动子和所述第二终止子之间，或者位于所述第二终止子和所述报告基因之间。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体而言，涉及一种基因表达盒及其在Cre-lox重组效率检测中的应用。

背景技术

Cre-lox技术是20世纪80年代从P1噬菌体中发现的一种位点特异性重组技术。该技术可通过Cre重组酶和lox位点的相互作用，实现目的片段的删除、翻转、插入和易位等。该技术不需要借助任何辅助因子，可作用于多种结构的DNA底物，如线形、环状甚至超螺旋DNA等，操作简单、快速、高效，因此被广泛应用于真核生物和原核生物的基因敲除、插入、翻转和易位等研究中。目前，Cre-lox系统应用最热门的领域是基因打靶，已被证明是哺乳动物细胞和小鼠遗传操作最有用的工具，该系统和基因打靶的结合提供了实现条件基因敲除或激活的手段。

Cre-lox系统包含两个组成部分：Cre重组酶和lox重组位点。Cre重组酶是1981年从噬菌体P1中发现的，属于λint酶超基因家族，其编码区序列全长1029bp，编码由343个氨基酸组成的38kDa单体蛋白，结构上由4个亚基和两个结构域组成：较大的羧基(C-末端)结构域和较小的氨基(N-末端)结构域，可特异性识别并介导lox位点之间的重组反应。lox重组位点来源于P1噬菌体，总长度为34bp，由不对称的8bp间隔区及侧翼为13bp的反向重复序列组成。其中，两个反向重复序列是Cre重组酶的特异性识别位点和结合域，中间的8bp间隔序列决定了lox位点的方向。最常用的lox位点是loxP(locus of X-over P1)，Cre重组酶介导两个loxP位点间的重组是一个动态可逆的过程，可根据两个loxP位点的方向、位置介导片段的删除、翻转、插入和异位等。使用loxP位点的一个潜在限制是，当存在多于两个loxP位点时，则无法控制哪些loxP位点之间发生重组，分子内事件的发生频率高于分子间事件，且任意两个位点之间都可能发生重组反应，这对于一些需要严格控制重组反应的实验是极为不利的，为了克服这一缺陷，人们通过突变loxP位点产生了具有各种不同功能的lox位点突变体，常用的lox突变体有lox2272、lox71和lox66等，根据其不同的应用形成了FLEX和lox66/lox71等系统。

Cre-loxP系统既可以在细胞水平上用Cre重组酶表达质粒转染靶细胞，通过识别loxP位点将抗性标记基因切除，又可以在个体水平上将重组杂合子小鼠与Cre转基因小鼠杂交，筛选子代小鼠就可得到删除外源标记基因的条件性敲除小鼠，因此，是最常用的一种Cre-lox系统。LoxP-Stop-LoxP系统是利用Cre介导的条件性基因表达系统，该系统含有3个SV40 polyA序列的LSL元件，其常规的表达结构为Promoter-LSL-GOI-PolyA。在没有Cre重组酶存在时，LSL可有效终止下游目的基因的转录，而在有Cre存在时LSL可被切除从而转录下游目的基因。当GOI为荧光蛋白时，可以很方便地通过检测荧光表达强度来判断Cre-loxP系统的重组效率。但是，当GOI为非发光的其他功能性蛋白时，只能通过蛋白表达水平来检测重组效率，不仅操作繁琐、耗时长、成本增加，而且检测结果与实际情况相比，具有较大误差，这就需要设计出一种更优的表达结构来解决这个问题。

发明内容

传统方法所采用的Promoter-LSL-GOI-PolyA表达结构具有明显的缺陷：在GOI为非荧光蛋白时，无法直观的观察并检测出Cre-lox的重组效率，而通过常规的蛋白检测方法都比较繁琐，且误差也相对较大，这也大大限制了该系统的应用范围。为解决上述问题，本发明提供如下技术方案：