[发明专利]一种培养基、其制备的角膜基质片和制备方法

说明书

本发明涉涉及医用生物材料技术领域，特别涉及一种培养基、其制备的角膜基质片和制备方法。本发明提供的培养基为含有猪角膜提取物、Y‑27632、ITS、FGF、抗坏血酸和胎牛血清的DMEM/F12培养基。本发明通过选择适宜的活性组分及配比，使得采用该培养基制得的角膜基质细胞和角膜基质片与传统培养基制得的角膜基质细胞和角膜基质片相比，具有维持角膜基质细胞表型、促进增殖、提高活力，抗纤维化和抗凋亡等功能。本发明所述角膜基质片以角膜透镜为原料，采用所述培养基培养制备得到，相比动物来源的角膜修复材料，具有良好的生物相容性、无抗原性，可用于角膜移植各种供体材料的替代物，能被广大患者接受并长期应用于临床。

技术领域

本发明涉及医用生物材料技术领域，尤其涉及一种培养基、其制备的角膜基质片和制备方法。

背景技术

在眼科疾病中，因角膜疾病致盲的患者超过300万例，其中，约80％患者可通过传统的角膜移植术脱盲，并恢复视力。目前角膜移植是角膜病盲患者恢复视力和复明的唯一希望，但由于我国角膜捐献数量极其有限，致使绝大多数患者因得不到可用的供体角膜而无法重见光明。与此同时，有些角膜疾病可以通过细胞治疗，替代已经死亡或者病态的角膜基质细胞，避免向角膜盲发展，从而达到治疗疾病、恢复角膜功能的作用，成为除角膜移植外又一治疗角膜疾病的方法。

应用角膜组织工程技术体外重建的组织工程人角膜基质，作为捐献角膜的替代物，已成为众多角膜病盲患者通过角膜移植而复明的希望。体外构建支架材料是构建组织工程角膜的重要环节，既能为细胞提供结构支撑，又能引导组织再生。因此，选择具有良好生物相容性并具有特定结构的支架材料是成功构建组织工程角膜的关键步骤。另外，体外培养数量足够多的具有生理功能的角膜基质细胞，为细胞治疗和组织工程角膜提供“种子细胞”，也是需要重视的重要环节。

用于组织工程角膜体外重建的载体支架材料目前主要有胶原蛋白及其复合材料和异种脱细胞角膜基质。胶原蛋白是人们常用的支架材料，但也存在一些不足，如机械强度低、在体内降解过快、移植后易钙化等，手术后一段时间内就发生碎裂，无法达到复明的效果，因此未被广泛推广。异种脱细胞角膜基质，特别是脱细胞猪角膜也是角膜修复材料研究的热点，但是作为异种角膜脱细胞处理后保留的细胞外基质仍具有潜在的抗原性，存在免疫排斥的可能；同时还具有传播潜在动物相关性疾病的危险，因此其安全性尚需要长期的随访研究。而且作为异种角膜能否被患者接受也是影响其临床应用的不可忽视的问题。除了不同来源的支架材料有各种利弊外，体外培养增殖角膜细胞的方法也各有优缺点。

在正常生理状态下的角膜基质内，安静型的角膜基质细胞呈树枝状或者星状，并且表达和分泌特征性的蛋白(如角膜蛋白、晶体蛋白等)，从而维持角膜正常的生理功能。而在体外培养时，尤其是用含有较高浓度的胎牛血清培养基时，角膜基质细胞很容易纤维化，细胞体积增大，变为长梭形的成纤维细胞，甚至成为体积更大的多边形肌成纤维细胞。同时，细胞的正常生理功能及表型也发生改变，合成并分泌使角膜变混浊的平滑肌动蛋白、纤连蛋白等。如果降低胎牛血清浓度培养，细胞因营养不足很难增殖并且很快凋亡。为了解决这一难题，目前国内外对于体外培养扩增角膜基质细胞的方法，主要包括球形培养、混合培养基培养和干细胞来源细胞培养等等。球形培养是模拟体内3D的细胞生长微环境，有利于促进和维持细胞表型和功能，但是目前仅限于动物细胞的研究，至于人类角膜基质细胞是否也适用，还需进一步研究。混合培养基里添加了各种维持细胞生长的细胞因子，可以代替高浓度血清，避免引起纤维化。但是这些细胞因子，有些已经商品化，而有些则需要从人体组织中提取，组织来源短缺，制作过程复杂，不易做到广泛应用。利用干细胞诱导分化为成体角膜基质细胞，为体外获得角膜基质细胞提供了一种新的途径，也最有可能得到广泛的应用，但目前研究较成熟的是向角膜上皮分化，近期有报道称，日本团队已经成功地将其应用于临床，治疗“角膜上皮干细胞衰竭症”。至于向角膜基质细胞分化，并应用于临床治疗角膜疾病，还需要时间进一步研究。

发明内容