[发明专利]能促进较大基因表达的Bcl2突变体及应用

说明书

本发明公开能促进较大基因表达的Bcl2突变体及应用。本发明Bcl2突变体为在小鼠Bcl2基因的第190位密码子由GGA突变为终止密码子TGA，或人Bcl2基因的第193位密码子由GGA突变为终止密码子TGA。本发明通过突变第568位(人Bcl2基因为577位)碱基，使G变为T，把该经过突变的磷酸化Bcl2与目的重组蛋白基因构建于双顺反子的表达载体上，就可以促进大于4.3kb的目的重组蛋白基因的表达。

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种能促进大于4.3kb基因表达的Bcl2突变体及应用。

背景技术

Bcl2基因是一个能抗细胞凋亡的基因，目前被用于基因治疗的体内筛选和生物制药中增加重组蛋白表达等。经研究发现，当把小鼠Bcl2的第69位的苏氨酸(T)、第70和84位(人Bcl2为第87位)的丝氨酸(S)突变为谷氨酸(E)(这三个位点氨基酸突变为谷氨酸的小鼠Bcl2为Bcl2^{T69E/S70E/S84E}，人的Bcl2为Bcl2^{T69E/S70E/S87E})，模拟在这三个位点磷酸化，就可显著提高Bcl2的抗凋亡能力，因此磷酸化的Bcl2蛋白也被应用于增加重组蛋白的表达量。但是对于目的重组蛋白基因比较大的(大于4.3kb，比如凝血因子VIII基因)基因，因为mRNA不稳定的原因，表达量比较低，影响了工业化生产这种大小的重组蛋白质。对于这种蛋白质，即使把其基因与模拟磷酸化的Bcl2构建在同一表达质粒进行共表达也对促进其表达效果不明显。

发明内容

本发明的一个目的是针对现有技术的不足，提供一种能促进大于4.3kb基因表达的Bcl2突变体。

本发明提供的技术方案：

本发明Bcl2突变体为在小鼠Bcl2基因的第190位密码子由GGA突变为终止密码子TGA，或人Bcl2基因的第193位密码子由GGA突变为终止密码子TGA。

即在小鼠Bcl2基因的第568位碱基(人Bcl2相应的为577位)，野生型的为G，只要把其突变为T，从而使得190位密码子(人相应为193位密码子)由GGA变为终止密码子TGA，也就是把Bcl2从189位(人为192位)后切除其尾巴，即可使Bcl2获得促进大于4.3kb基因表达的能力。当该Bcl2突变体与大于4.3kb目的基因构建于同一表达质粒共表达时，就可大大促进目的基因的表达。

作为优选，本发明Bcl2突变体还包括小鼠Bcl2基因的第69位的苏氨酸残基(T)突变为谷氨酸残基(E)、第70位的丝氨酸残基(S)突变为谷氨酸残基(E)、第84位的丝氨酸残基(S)突变为谷氨酸残基(E)；或人Bcl2基因的第69位的苏氨酸残基(T)突变为谷氨酸残基(E)、第70位的丝氨酸残基(S)突变为谷氨酸残基(E)、第87位的丝氨酸残基(S)突变为谷氨酸残基(E)。

本发明的另一个目的是将上述新型Bcl2突变体和目的基因构建在能同时表达双基因的载体质粒上的应用。上述目的基因大于4.3kb。

作为优选，新型Bcl2突变体连接在内部核糖体进入位点(internal ribosomeentry site,IRES)下游，把目的基因连接在IRES上游。

所述的大于4.3kb目的基因包括B区域删除的凝血因子八(BDD FVIII)、全长凝血因子八(FVIII)。

本发明的有益效果是：

本发明通过突变第568位(人Bcl2基因为577位)碱基，使G变为T，把该经过突变的磷酸化Bcl2与目的重组蛋白基因构建于双顺反子的表达载体上，就可以促进大于4.3kb的目的重组蛋白基因的表达。

附图说明

图1A为构建有GFP-BDD FVIII或者BDD FVIII或者FVIII基因和小鼠Bcl2或人Bcl2(标记为hBcl2)突变体基因的逆转录病毒载体质粒示意图。