[发明专利]一种斑马鱼胚胎心脏免疫荧光标记法

说明书

本发明公开了一种斑马鱼胚胎心脏免疫荧光标记法，其特征在于，包括以下步骤：S1、取干净载玻片用荧光记号笔画直径为1cm的圆圈，在圆圈中加入多聚甲醛，将载玻片放入湿盒中；S2、固定斑马鱼心脏；S3、洗涤；S4、封闭；S5、重复步骤S3；S6、加入一抗，4℃孵育过夜；S7、次日室温放置湿盒；S8、重复步骤S3；S9、加入二抗，室温避光孵育；S10、重复步骤S3；S11、在荧光显微镜或激光共聚焦下成像，拍照记录结果。本发明解决了整鱼做免疫荧光时心脏染不上色，PBST洗涤过程中心脏容易丢失，二抗体孵育后样本不能长期保存以及抗体使用量大的问题，此方法操作简单、抗体用量少、封片后样本可保存两周，在显微镜下直接观察心脏个体，保证了实验的准确性。

技术领域

本发明涉及体外诊断技术领域，具体涉及一种的斑马鱼胚胎心脏免疫荧光标记法。

背景技术

斑马鱼身体延长而略呈纺锤形，头小而稍尖，吻较短，全身布满多条深蓝色纵纹似斑马，与银白色或金黄色纵纹相间排列纹路比较有条理。在水族箱内成群游动时犹如奔驰于非洲草原的斑马群，故此得斑马鱼之美称。斑马鱼和人类基因有着87％的高度相似性，作为模式生物的优势很突出，这意味着其实验结果大多数情况下适用于人体。常可用于水质环境的监测。同时斑马鱼也是一种常见的观赏鱼。斑马鱼的孵育与繁殖不仅能够带来较大的经济效益同时也具有不可忽略的生物医学研究价值。在斑马鱼的养殖过程中，心脏是最早形成并发挥功能的器官之一，为了准确地判断斑马鱼胚胎心脏发育早期的状态，提高斑马鱼的孵育质量，利用免疫荧光法对心脏中特异性表达物质进行检测，并制作成标本观察保存。

而目前现有技术中存在的问题包括：整鱼做免疫荧光时，抗体很难结合到心脏部位，导致最后在荧光显微镜下心脏部位没有颜色，且抗体用量极大，极大增加实验成本；现有的技术将心脏取出固定后，在洗涤过程中由于心脏在PBST中有流动性，很容易丢失；二抗孵育结束洗涤后直接在荧光显微镜下成像，样本只能使用一次。

发明内容

针对上述现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种的斑马鱼胚胎心脏免疫荧光标记法，以此解决整鱼做免疫荧光时心脏染不上色，PBST洗涤过程中心脏容易丢失，第二抗体孵育后样本不能长期保存以及抗体使用量大的问题，此方法操作简单、抗体用量少、封片后样本可保存两周，在显微镜下直接观察心脏个体，保证了实验的准确性。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种斑马鱼胚胎心脏免疫荧光标记法，包括以下步骤：

S1、取干净载玻片用荧光记号笔画直径为1cm的圆圈，在圆圈中加入50μl4％多聚甲醛，将载玻片放入湿盒中；

S2、在显微镜下取斑马鱼心脏放入4％多聚甲醛中固定；

S3、洗涤；

S4、取50μl，5％BSA加入载玻片圆圈中，放入湿盒中封闭；

S5、封闭后重复步骤S3；

S6、加入50μl PBST配置的一抗，将载玻片放进湿盒中，4℃孵育过夜；

S7、次日室温放置湿盒，便于抗体结合；

S8、恢复至室温后重复步骤S3；

S9、加入50μl PBST配置的带有荧光标记物的二抗，室温避光孵育；

S10、在显微镜下重复步骤S3；

S11、加入20μl的荧光猝灭剂，将圆圈中的心脏在荧光显微镜或激光共聚焦下成像，拍照记录结果。

进一步地，步骤S2中的待测样品固定后在显微镜下吸弃4％多聚甲醛，室温干燥，使其完全贴在载玻片上，便于后续洗涤。