[发明专利]一种基于DNA甲基化的罗氏沼虾“铁壳虾”检测方法及其检测流程

权利要求书

1.一种基于DNA甲基化的罗氏沼虾“铁壳虾”检测方法，其特征在于，所述方法包含5个DNA甲基化位点：A(1-59)，B(1-214)，C(2-302)，D(3-221)，E(4-417)；

A，B，C，D，E 5个位点分别由引物1，引物1，引物2，引物3，引物4这4对引物扩增获得；

4对引物信息如下：

引物1：F-GACTGCGTACCAATTCACT，R-GATGAGTCTAGAACGGTCA；

引物2：F-GACTGCGTACCAATTCACT，R-GATGAGTCTAGAACGGTAG；

引物3：F-GACTGCGTACCAATTCACT，R-GATGAGTCTAGAACGGTGT；

引物4：F-GACTGCGTACCAATTCATC，R-GATGAGTCTAGAACGGTGT；

A，B，C，D，E 5个位点权重分别为：0.3，0.3，0.2，0.1，0.1；

每个个体在每个位点出现甲基化记为1，不出现甲基化记为0，5个位点加权计算后，数值大于0.5则判断为“铁壳虾”。

2.一种如权利要求1所述的基于DNA甲基化的罗氏沼虾“铁壳虾”检测方法，其特征在于，步骤如下：

(1)待测样品基因组DNA提取；

(2)对待测样品DNA采用2U的限制性内切酶EcoRI和HpaII/Msp I进行双酶切；

(3)将酶切产物与接头序列进行连接；

(4)连接产物使用TE_0.1进行10倍稀释后进行预扩增；

(5)预扩产物稀释20倍后采用4对引物进行选择性扩增；

(6)根据条带的有无判断上述5个位点的DNA甲基化情况，位点存在DNA甲基化则记录为1，位点不存在DNA甲基化则记录为0；

(7)将5个位点的DNA甲基化情况进行加权计算，根据标准值0.5进行“铁壳虾”概率的判断。

3.根据权利要求2所述的基于DNA甲基化的罗氏沼虾“铁壳虾”检测方法，其特征在于，步骤(2)中，酶切体系为：

反应物	酶切体系
基因组DNA	100ng
10×Buffer Tango	2μl
EcoRI	2U
HpaII/MspI	2U
2O]]>	补足至10μl

。