[发明专利]一种抗AMH单克隆抗体及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种抗AMH单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

AMH蛋白的制备：将AMH基因片段插入pET-28a(+)质粒中，获得重组质粒表达载体；将所述重组质粒表达载体转入大肠杆菌中，然后在含有IPTG的LB液体培养基中25-37℃诱导培养4-6h，提取、纯化即得高纯度的AMH蛋白；所述AMH基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

动物免疫：将45-55μg所述AMH蛋白与相同体积的福氏佐剂充分乳化后，于BALB/c小鼠背部皮下多点注射免疫三次，每次免疫时间间隔为14d，筛选体内抗体效价为1：(100000-128000)的小鼠作为免疫小鼠；

杂交瘤细胞的制备：对所述免疫小鼠腹腔注射不加佐剂的AMH重组蛋白95-105μg，提取脾细胞悬浮液与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合，经选择性培养后，再进行3次亚克隆，即得能稳定分泌特异性抗AMH抗体的杂交瘤细胞；

单克隆抗体的制备：选取8-10周龄的BALB/c小鼠腹腔注射降酯烷，7d后接种所述杂交瘤细胞(0.8-1.2)×10⁶个/只，抽取腹水，经提取、纯化后得到抗AMH单克隆抗体。

2.根据权利要求1所述的抗AMH单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述IPTG在所述LB液体培养基中的终浓度为0.4-0.6mM；所述诱导培养的温度为37℃，所述诱导培养的时间为4h。

3.根据权利要求1所述的抗AMH单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述大肠杆菌为BL21(DE3)大肠杆菌。

4.根据权利要求1所述的抗AMH单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述小鼠骨髓瘤细胞SP2/0与脾细胞悬浮液的体积比为1:5。

5.根据权利要求1所述的抗AMH单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述AMH蛋白的纯化方法为NI-NTA亲和层析柱纯化。

6.根据权利要求1所述的抗AMH单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述免疫小鼠的效价为1:128000。

7.根据权利要求1所述的抗AMH单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述选择性培养采用的培养基为添加有胎牛血清、次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶的DMEM培养基。

8.根据权利要求1所述的抗AMH单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述抗AMH单克隆抗体的纯化方法为Protein G亲和层析法。

9.一种抗AMH单克隆抗体，其特征在于，由权利要求1-8任一项所述的抗AMH单克隆抗体的制备方法制备而成,所述抗AMH单克隆抗体为IgG1亚型。

10.一种如权利要求9所述的抗AMH单克隆抗体在免疫检测AMH产品中的应用。