[发明专利]一种抗AMH单克隆抗体及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种抗AMH单克隆抗体的制备方法，包括AMH蛋白的制备、动物免疫、杂交瘤细胞的制备和单克隆抗体的制备，选择特定的AMH基因片段，优化了原核表达系统的条件，提高了蛋白的表达量和重组蛋白的纯度，筛选的杂交瘤细胞株可持久、高效分泌高性能的抗AMH单克隆抗体。本发明还公开了一种抗AMH单克隆抗体，均为IgG1亚型，抗体的一致性好，效价可达7.8ng/mL，免疫活性高、亲和力强、稳定性强。本发明还公开了一种上述单克隆抗体在免疫检测AMH产品中的应用，检测特异性强、灵敏度高、准确性好，可促进国产诊断试剂的发展，推动AMH检测的普及。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种抗AMH单克隆抗体及其制备方法和应用。

背景技术

抗苗勒管激素(anti-Mμllerian hormone,AMH)作为女性卵巢储备功能的评价以及辅助生殖技术中卵巢反应性评估的激素，是由睾丸支持细胞和卵巢颗粒细胞分泌。随着国内“二孩”政策的开放，评估高龄女性卵巢储备功能成为了辅助生殖技术中至关重要的一环。与其他临床常用卵巢功能的生物学指标相比AMH浓度相对稳定，研究表明抗苗勒管激素是评价卵巢储备功能的稳定指标，不受月经周期、口服避孕药、促性腺激素释放激素的影响，是评价卵巢储备功能最直接、准确的指标。血清AMH的水平与年龄呈负相关，其水平低于相应年龄段正常参考范围，则可认为卵巢早衰；高水平的AMH为多囊卵巢综合症的诊断提供依据。

AMH检测在临床上的应用具有广泛意义，是目前预测卵巢反应、评估卵巢刺激治疗效果的最理想生物标志物。早期建立的AMH检测方法是免疫细胞化学检测及RIA，无法应用于临床检测诊断。第一代AMHELISA检测技术已开始满足临床检测的需求，但没有统一的检测标准，其结果易受样品储存及反复冻融的影响，稳定性较差。Beckman的第二代AMH ELISA检测技术统一了AMH的检测标准。发展到今天，罗氏诊断及Beckman的全自动AMH ELISA检测技术，为AMH提供了相对准确、灵敏、快速、方便的检测方法。但国内AMH商品化检测系统发展较为落后，基本被国外顶级体外诊断试剂厂家所垄断；且AMH检测系统配置较高、普及率低，检测价格昂贵，不利于AMH检测的推广。进一步开发出高性能的抗体，将其应用于全自动免疫分析仪的试剂，甚至将其应用于免疫层析试纸条检测AMH，把AMH检测纳入常规临床检验，为中国女性及不孕症患者提供全方位的生殖健康管理势在必行。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种抗AMH单克隆抗体的制备方法，选取特定的AMH基因片段，优化了原核表达系统的条件，提高了蛋白的表达量和重组蛋白的纯度；同时优化了动物免疫处理及杂交瘤细胞等环节的参数，可以产生更高效价的抗体，制备的杂交瘤细胞株可持久、高效分泌高性能的抗AMH单克隆抗体。

本发明的目的之二在于提供一种上述方法制备的抗AMH单克隆抗体，均为IgG1亚型，抗体的一致性好，效价可达7.8ng/mL，免疫活性高、亲和力强。

本发明的目的之三在于提供一种上述AMH单克隆抗体在免疫检测AMH产品中的应用，抗体的稳定性强，检测特异性强、灵敏度高、准确性好，可促进国产诊断试剂的发展，摆脱昂贵进口试剂的束缚，并推动AMH检测的普及，让科学的评价手段惠及更多的人群。

本发明的目的之一采用如下技术方案实现：

一种抗AMH单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：

AMH蛋白的制备：将AMH基因片段插入pET-28a(+)质粒中，获得重组质粒表达载体；将所述重组质粒表达载体转入大肠杆菌中，然后在含有IPTG的LB液体培养基中25-37℃诱导培养4-6h，提取、纯化即得高纯度的AMH蛋白；所述AMH基因片段的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示；