[发明专利]一种大规模制备高纯度不饱和透明质酸二糖的方法

权利要求书

1.一种大规模制备高纯度不饱和透明质酸二糖的方法，其特征是包括以下步骤：

（1）将透明质酸酶加入pH4~9的水中，配成酶解缓冲液；

（2）在搅拌下向酶解缓冲液中加入高分子透明质酸或其盐，高分子透明质酸或其盐与酶解缓冲液的质量体积比为1~2 g:10 ml，酶解至透明质酸或其盐的分子量为50 kDa~100kDa时升温进行灭活；

（3）向步骤（2）灭活后的反应液中加入有机溶剂进行沉淀，过滤，所得沉淀洗涤、干燥，得低分子量透明质酸或其盐；

（4）按照步骤（1）的方法配制酶解缓冲液，在搅拌下向该酶解缓冲液中加入步骤（3）的低分子量透明质酸或其盐，低分子量透明质酸或其盐与酶解缓冲液的质量体积比为3~9 g：10 ml，酶解直至终点；

（5）将酶解液用活性炭进行吸附，吸附后过滤，所得滤液用有机溶剂沉淀，所得沉淀干燥，得不饱和透明质酸二糖；

步骤（1）中，所述透明质酸酶为芽孢杆菌（Bacillus sp.）A50 CGMCC NO.5744发酵生产的透明质酸酶，其比活大于1.4×10⁷ IU/mg；

步骤（2）中，所述高分子透明质酸或其盐以连续的方式加入或以间歇的方式加入；

步骤（3）和（5）中，所述有机溶剂均为乙醇、丙醇、异丙醇或乙二醇。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是：步骤（2）中，酶解缓冲液中透明质酸酶的用量与加入的高分子透明质酸或其盐总质量的比值为：1×10⁵~1×10⁶ IU：1 kg；步骤（4）中，酶解缓冲液中透明质酸酶的用量与加入的低分子量透明质酸或其盐总质量的比值为：1×10⁷~1×10⁹ IU：1 kg。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是：步骤（4）中，低分子量透明质酸或其盐与酶解缓冲液的质量体积比为4.5~7.5 g：10 ml。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是：步骤（3）和（5）中，所述有机溶剂均为乙醇。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是：步骤（3）中，加入有机溶剂至酶解液中有机溶剂的体积浓度为70%~85%。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是：步骤（5）中，加入有机溶剂至酶解液中有机溶剂的体积浓度为88~99%。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是：步骤（5）中，加入有机溶剂至酶解液中有机溶剂的体积浓度为90~92%。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的制备方法，其特征是：步骤（4）中，所述低分子量透明质酸或其盐以连续的方式加入或以间歇的方式加入。

9.根据权利要求1-7中任一项所述的制备方法，其特征是：步骤（2）中，所述高分子透明质酸或其盐的分子量大于等于1000 kDa。

10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征是：步骤（2）中，所述高分子透明质酸或其盐的分子量为1000 kDa~2000 kDa。

11.根据权利要求1-7中任一项所述的制备方法，其特征是：步骤（2）中，所述高分子透明质酸盐为透明质酸的钠盐、钾盐、钙盐或镁盐。

12.根据权利要求1-7中任一项所述的制备方法，其特征是：步骤（2）中，搅拌速度为10~50 rpm；步骤（4）中，搅拌速度为10~50 rpm。

13.根据权利要求1-7中任一项所述的制备方法，其特征是：步骤（2）和（4）中，酶解温度均为20~48℃；步骤（2）和（4）中，酶解pH均为5.5~7.5。