[发明专利]一种大规模制备高纯度不饱和透明质酸二糖的方法

说明书

本发明公开了一种大规模制备高纯度不饱和透明质酸二糖的方法，该方法采用两步酶解和两步纯化，先利用透明质酸酶酶解高分子透明质酸或其盐，所得产物用低有机溶剂倍数进行纯化，得到纯度较高的低分子量透明质酸或其盐，进而对低分子量透明质酸或其盐进行彻底酶解，所得产物用高有机溶剂倍数进行纯化，得到高纯度不饱和透明质酸二糖。该方法工艺流程操作简单，条件温和，生产效率高，能耗相对较低，适合大规模工业化生产。所得产品纯度高、细胞毒性低、具有促进人脐静脉内皮细胞及人角膜上皮细胞增殖的特点，可以作为标准品用作透明质酸及其相关产品的含量及纯度检测，在医药领域也具有广阔的应用前景。

技术领域

本发明涉及一种不饱和透明质酸二糖的制备方法，特别涉及一种纯度高、产量大、适合大规模生产的不饱和透明质酸二糖的制备方法，属于寡聚透明质酸制备技术领域。

背景技术

透明质酸(hyaluronic acid，HA)是一种广泛存在于人及哺乳动物体内的酸性黏多糖，是由N-乙酰氨基葡糖和D-葡糖醛酸双糖重复单位通过β-(1→4)糖苷键和β-(1→3)糖苷键构成、无分支的单链高分子糖胺聚糖。由于透明质酸独特的物理学特性、高保湿性、粘弹性、润滑性，广泛用于医药、化妆品、食品等领域，分子量一般为10⁵~10⁷Da（道尔顿）。

寡聚透明质酸是指分子量小于10 kDa的透明质酸。有研究认为，不同的分子量的透明质酸有着不同的甚至完全相反的生物活性，高分子量透明质酸由于其保湿性、粘弹性及润滑性常被应用在滴眼液、美容填充及骨科填充等领域，但当透明质酸的分子量降低至寡糖的水平时（10 kDa以下），透明质酸寡糖表现出与高分子量透明质酸完全不同的性能，具有抗氧化性、透皮吸收、创伤修复的活性。不饱和透明质酸二糖分子量为383Da，是透明质酸经过细菌产透明质酸酶酶解制备的透明质酸二糖，与透明质酸二糖结构相区别的是，不饱和透明质酸二糖在葡萄糖醛酸的4,5糖苷键处形成不饱和键。经前期研究发现，不饱和透明质酸二糖（ΔDiHA）具有较强的抗氧化性，并能够明显促进人脐静脉内皮细胞及人角膜上皮细胞增殖，在医药领域具有广阔的应用前景。另外，高纯度不饱和透明质酸二糖（ΔDiHA）也可以作为标准品，用作透明质酸及其相关产品的含量及纯度检测。

李强在其毕业论文中公开了一种不饱和透明质酸二糖的制备方法（李强. 不饱和透明质酸二糖的制备和活性研究[D]. 山东大学, 2013），该方法以高分子透明质酸为原料，通过一次酶解、酶灭活、冷冻干燥的步骤制备不饱和透明质酸二糖。该工艺采用冻干工艺得到不饱和透明质酸二糖，批次产量过低，高耗能，效率低下，无法应用于透明质酸不饱和二糖的大规模制备。有机溶剂沉淀提取产物的方式是工业上常用的透明质酸提取方式，但由于不饱和透明质酸二糖自身的吸水性高，分子量低(383 Da)，且采用高分子透明质酸为原料，溶液中底物浓度低，因此很难通过有机溶剂沉淀的方式得到不饱和透明质酸二糖。

CN107460184A 公开了一种链霉菌属来源的透明质酸裂解酶HyaL16-3及其编码基因与应用，其将透明质酸裂解酶HyaL16-3的编码基因插入到表达载体中，使其在宿主细胞大肠杆菌BL21(DE3）中表达，所得透明质酸裂解酶用于降解透明质酸，从而制备不饱和透明质酸二糖。该专利所得的透明质酸裂解酶酶活很低，其对透明质酸的比活仅为10306 U/mg，容易引入更多杂质，降解后需要经过分子凝胶色谱柱分离纯化，并需经过反复冷冻干燥脱盐才能得到纯度较高的不饱和透明质酸二糖。该方法工艺复杂、产品纯化难度大、能耗高、成本高，无法实现大规模生产，且重组菌株的安全性也有待考量。

CN201210499375.8公开了一种低分子透明质酸盐的酶解制备方法，采用0.1%~2%的透明质酸盐溶液进行酶解，然后加入无机盐以便增强溶液的离子强度进而进行有机溶剂沉淀获得低分子透明质酸及其盐，随着低分子透明质酸及其盐分子量的降低，需要不断的提高有机溶剂的添加浓度以使透明质酸沉淀析出，但无机盐在高浓度的有机溶剂中也会沉淀析出，因此在沉淀的过程中势必会造成无机盐残留。