[发明专利]一种澳洲坚果叶片总蛋白质的高效提取方法

权利要求书

1.一种澳洲坚果叶片总蛋白质的高效提取方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1.将澳洲坚果新鲜叶片液氮研磨粉碎后，加入预冷裂解液PW1进行一次提取，经固液分离后得到第一沉淀，清洗并晾干第一沉淀；

S2.向第一沉淀中加入提取液PW2进行二次提取，经固液分离后得到第二上清液，加入预冷甲醇溶液，离心，获得第二沉淀，清洗并烘干第二沉淀；

S3.向第二沉淀中加入溶解液PW3进行三次提取，经固液分离后得到第三上清液，即得所述澳洲坚果叶片总蛋白质；

其中，所述裂解液PW1的配方为：10％～12％三氯醋酸、0.01％～0.05％聚乙烯吡咯烷酮、10～50mmol/L二硫苏糖醇，溶剂为丙酮；

所述提取液PW2的配方为：55％～70％Tris饱和酚溶液、10％～15％蔗糖、0.8％～1.5％十二烷基硫酸钠、0.03～0.06mol/L的Tris-HCl缓冲液、20～50mmol/L二硫苏糖醇、0.5～1.5mmol/L苯甲基磺酰氟；

所述溶解液PW3的配方为：0.1％～0.3％十二烷基硫酸钠、6～8mol/L尿素、1～3mol/L硫脲、20～30mmol/L的Tris-HCl缓冲液、10～50mmol/L二硫苏糖醇。

2.根据权利要求1所述的高效提取方法，其特征在于，所述提取液PW2中Tris-HCl缓冲液的pH值为7.8～8.2；所述溶解液PW3中Tris-HCl缓冲液的pH值为6.6～7.0。

3.根据权利要求1所述的高效提取方法，其特征在于，S1中所述裂解液PW1的添加量为：控制S1样品粉末与裂解液PW1的质量体积比为1～2g：3～6mL。

4.根据权利要求1所述的高效提取方法，其特征在于，S2中所述提取液PW2的添加量为：控制S1样品粉末与提取液PW2的质量体积比为1～2g：4～8mL。

5.根据权利要求1所述的高效提取方法，其特征在于，S3中所述溶解液PW3的添加量为：100～500μL。

6.根据权利要求1所述的高效提取方法，其特征在于，S1中所述清洗为：取5～10mL的甘油乙醇溶液混匀沉淀后，于4～6℃、3000～5000rpm条件下离心1～3min，吸除清洗液后，再采用同样方法用丙酮溶液清洗1～2次。

7.根据权利要求6所述的高效提取方法，其特征在于，所述甘油乙醇溶液以90％～95％乙醇配制，其浓度为2％～3％；所述丙酮溶液的浓度为78％～82％。

8.根据权利要求1所述的高效提取方法，其特征在于，S2中所述甲醇溶液含有0.05～0.15mol/L醋酸铵；所述甲醇溶液的添加量为第二上清液的5～6倍。

9.根据权利要求1所述的高效提取方法，其特征在于，S2中所述清洗为依次采用甲醇、78％～82％丙酮清洗2～3次；S2中所述烘干为于48～52℃温度下烘干。

10.根据权利要求1所述的高效提取方法，其特征在于，S1中提取条件为：加入3～5℃预冷裂解液PW1混匀后，冰上静置5～10min，期间旋涡混匀2～3次，再于3～5℃、3000～5000rpm条件下离心2～4min；

S2中提取条件为：加入提取液PW2混匀后，冰上静置5～10min，再加入3～5℃预冷甲醇溶液混匀后，于-20～-10℃静置1～12h，再于3～5℃、12000～14000rpm离心8～12min；

S3中提取条件为：加入溶解液PW3后，旋涡震荡20～30S，90～95℃水浴4～6min，再于3～5℃、12000～14000rpm离心8～12min。