[发明专利]一种澳洲坚果叶片总蛋白质的高效提取方法

说明书

本发明公开了一种澳洲坚果叶片总蛋白质的高效提取方法。包括以下步骤：将澳洲坚果新鲜叶片液氮研磨粉碎后，加入预冷裂解液PW1进行一次提取，经固液分离后得到第一沉淀，清洗并晾干第一沉淀；加入提取液PW2进行二次提取，经固液分离后得到第二上清液，加入预冷甲醇溶液，离心，获得第二沉淀，清洗并烘干第二沉淀；加入溶解液PW3进行三次提取，经固液分离后得到第三上清液，即得。本发明以新鲜澳洲坚果叶片为材料，向澳洲坚果叶片粉末加入本发明的3种提取液可有效避免原料氧化，避免蛋白质降解，总蛋白质得率高，所提取蛋白纯度高，SDS‑PAGE电泳条带整洁清晰，并适用于Western Blot分析。

技术领域

本发明属于蛋白质提取技术领域。更具体地，涉及一种澳洲坚果叶片总蛋白质的高效提取方法。

背景技术

澳洲坚果(Macadamia ternifolia F.Muell.)，又称昆士兰栗、夏威夷果、澳洲胡桃，属山龙眼科澳洲坚果属，常绿乔木，原产于澳大利亚昆士兰州东南部和新南威尔州北部、南纬25°～31°的沿海亚热带雨林。澳洲坚果营养丰富，含油量为70％～79％，尤其富含不饱和脂肪酸，蛋白质丰富，还含有丰富的磷、钙、铁、维生素、氨基酸等，素有“干果皇后”、“世界坚果之王”的美称。目前，国内外对澳洲坚果的研究主要集中在栽培技术推广、种质鉴定、资源利用等方面，对于澳洲坚果的抗逆性以及代谢调控机理的研究较少。

利用蛋白质组学技术对蛋白质种类、丰度、修饰、蛋白质互作以及蛋白质复合体的研究成为热点，并为研究植物抗逆性以及代谢调控机理奠定基础。然而，澳洲坚果属于“顽拗植物”，其组织细胞内含有大量多糖、色素、多酚等次级代谢产物，利用传统TCA/丙酮提取液提取蛋白质过程中澳洲坚果叶片极易氧化褐变，造成蛋白质降解、提取率低甚至失败，少数所获得的蛋白质样品不易溶解、粘稠、纯度低，严重影响蛋白质组学分析。

专利文献CN 104336296 B、CN 109043117 A、CN 103719531 A和CN 103652313 A均涉及到了以脱油后的澳洲坚果油粕为原料提取、生产蛋白质的方法，但上述专利均是针对澳洲坚果果实中蛋白质的提取，很少有涉及到澳洲坚果叶片中蛋白质的提取纯化研究，果实与叶片的结构不同，蛋白质在果实与叶片中的分布不一样，从果实与叶片中提取蛋白质的目的也不相同。从澳洲坚果果实中提取的蛋白质一般用作食品营养补充剂或添加剂，而从叶片中提取蛋白质主要用作蛋白质组学分析，为研究澳洲坚果的抗逆性以及代谢调控机理奠定基础。因此，针对澳洲坚果富含色素、多糖、多酚等次级代谢产物的特性，开发一种高效的澳洲坚果叶片总蛋白质的提取方法意义重大。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种澳洲坚果叶片总蛋白质的高效提取方法，采用该方法所提取的澳洲坚果叶片总蛋白质纯度高，SDS-PAGE电泳条带整洁清晰，并适用于Western Blot分析，有效解决了澳洲坚果叶片总蛋白在传统提取过程中极易氧化褐变，所提取得到的蛋白质纯度不高的问题。

本发明通过以下技术方案实现：

一种澳洲坚果叶片总蛋白质的高效提取方法，包括以下步骤：

S1.将澳洲坚果新鲜叶片液氮研磨粉碎后，加入预冷裂解液PW1进行一次提取，经固液分离后得到第一沉淀，清洗并晾干第一沉淀；

S2.向第一沉淀中加入提取液PW2进行二次提取，经固液分离后得到第二上清液，加入预冷甲醇溶液，离心，获得第二沉淀，清洗并烘干第二沉淀；

S3.向第二沉淀中加入溶解液PW3进行三次提取，经固液分离后得到第三上清液，即得所述澳洲坚果叶片总蛋白质；

其中，所述裂解液PW1的配方为：10％～12％三氯醋酸、0.01％～0.05％聚乙烯吡咯烷酮、10～50mmol/L二硫苏糖醇，溶剂为丙酮；