[发明专利]猪用三联灭活疫苗及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种猪用三联灭活疫苗，其特征在于，包括：表达O型FMDV VP1基因的重组杆状病毒、猪塞内卡病毒、H3N2亚型猪流感病毒和免疫佐剂。

2.按照权利要求1所述的猪用三联灭活疫苗，其特征在于，所述表达O型FMDV VP1基因的重组杆状病毒的构建方法包括：

(1)将O型FMDV VP1基因克隆至pFastBacⅠ载体得到重组质粒pFB-FMDV-vp1；(2)用重组质粒pFB-FMDV-vp1构建得到重组穿梭杆状质粒rBacmid-FMDV-vp1；(3)将重组穿梭杆状质粒转染昆虫细胞，得到表达O型FMDV VP1基因的重组杆状病毒。

3.按照权利要求2所述的猪用三联灭活疫苗，其特征在于，所述的O型FMDV VP1基因是密码子优化后的基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示；所述的昆虫细胞为Sf9细胞。

4.按照权利要求1所述的猪用三联灭活疫苗，其特征在于，所述猪塞内卡病毒的微生物保藏编号为：CGMCC No.18851。

5.按照权利要求1所述的猪用三联灭活疫苗，其特征在于，所述的H3N2亚型猪流感病毒微生物保藏编号为：CGMCC No.14740。

6.一种制备权利要求1所述猪用二联灭活疫苗的方法，包括：

(1)将表达O型FMDV VP1基因的重组杆状病毒进行扩增后灭活；将猪塞内卡病毒进行扩增后灭活；(2)将灭活的表达O型FMDV VP1基因的重组杆状病毒液、灭活的猪塞内卡病毒液以及灭活的H3N2亚型猪流感病毒液混合均匀得到水相；(3)将免疫佐剂加热得到油相；(4)将油相加入到水相中混合，乳化，即得。

7.按照权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(2)中将灭活的FMDV-vp1重组杆状病毒液和猪塞内卡病毒液混合后使使每头份疫苗中FMDV-vp1蛋白含量不小于40μg、猪塞内卡病毒不小于10^8.0TCID₅₀、猪流感病毒不小于10^7.5EID₅₀。

8.按照权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的免疫佐剂为Montanide^TM206佐剂。

9.按照权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(3)中将免疫佐剂加热至30℃得到油相。

10.按照权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(4)中控制油相和水相的体积比为1:1；所述的乳化包括：先将水相加入乳化罐内慢速搅拌然后缓慢加入油相佐剂，加完后以800r/min搅拌30分钟，再静止30分钟。