[发明专利]一种CRISPR介导的快速检测植物基因功能的系统

说明书

本发明公开了一种CRISPR介导的快速检测植物基因功能的系统，其特征在于，在Cas蛋白转基因植株中转入含有目的基因gRNA序列的重组病毒载体。本发明克服了现有植物研究领域中采用CRISPR/Cas系统要得到纯合突变体至少需要通过两到三代的植物生长周期的技术缺陷，提供了一种可以快速研究植物基因功能的系统，通过在已经转入Cas基因的转基因植株中转入含有gRNA序列的重组病毒载体，可以于当代检测目的基因的功能；并且由于转入了含有gRNA序列的重组病毒载体，在受感染植株体内形成sgRNA，引导Cas9对目标基因进行切割，有机会获得基因突变的种子，大大缩短了实验耗时和脱靶失败的概率。

技术领域

本发明属于基因编辑技术领域，更具体地，涉及一种CRISPR介导的快速检测植物基因功能的系统。

背景技术

成簇规律间隔回文重复序列CRISPR(Clustered Regularly Interspaced ShortPalind-romic Repeats)和CRISPR相关核酸酶Cas(CRISPR-associated nuclease)系统是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御机制。该系统能够识别自身序列和外源入侵DNA片段，并剪切掉外源片段，从而达到保护自己的目的。科学家将这种免疫机制开发成为一种基因定点编辑技术，广泛应用于生物学和医学研究。CRISPR/Cas系统通过向导RNA(guide RNA，gRNA)序列，一方面特异识别待编辑的基因组DNA靶位点序列，另一方面引导Cas蛋白定点切割靶位点，使DNA靶位点形成双链缺口，细胞通过同源重组修复或者非同源性末端连接对断裂的DNA进行修复，从而实现基因的编辑。

在植物研究领域，CRISPR/Cas系统的用途之一是培育突变植株，以检测被突变的目的基因的功能。此方式虽然能够很直接客观的检测观察到目的基因在植株中所发挥的作用，但是，使用CRISPR/Cas系统培育突变植株的过程耗时漫长，导致验证基因功能实验整体耗时漫长。具体地，CRISPR/Cas系统培育突变植株的过程如下所示：在T0代幼期或愈伤组织进行目的基因的编辑；待T0代发育成熟后，自交得到T1代，使用分子标记或表型观测对T1代基因组DNA进行检测，查看是否得到杂合突变体和纯合突变体。若得到纯合突变体则完成了突变植株的培育；若没有得到纯合突变体只得到杂合突变体，则继续自交杂合突变体并于T2代中筛选出纯合突变体；得到稳定遗传的纯合突变体之后，即可检测或者表型观测被突变的目的基因的功能。可见，在实验顺利的情况下，要得到纯合突变体至少需要通过两到三代的植物生长周期，而在发生脱靶或者植株培育不良等失误的情况下，即实验进行不顺，则耗费的时间更久。

病毒诱导的基因沉默(Virus-induced gene silencing，VIGS)是一种转录后基因沉默技术，广泛应用于植物基因工程的研究中。其作用原理是植物在抵御病毒侵染时会启动RNA沉默(RNA silencing，RNAi)机制。具体地，首先，病毒在植物体内的复制和表达过程中形成双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)；然后，dsRNA被Dicer酶切割成21-23nt长度的小分子干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)；接下来，siRNAs进一步扩增，并以单链形式与Argonatute蛋白和RNase结合形成RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencingcomplex，RISC)；最后，RISC与同源RNA特异性互补结合，导致同源mRNA被降解，无法正常翻译蛋白，发生转录后水平的基因沉默。在植物基因工程中，将寄主植物基因的片段克隆到VIGS病毒载体中，当寄主植物通过RNA沉默引起防御反应时，相应的寄主基因也会被沉默，从而便于研究被沉默的基因的功能。

VIGS技术于当代就可以观察到表型，并可能遗传给后代，相比于培育纯合突变体，大大节约了时间；并且，相对于基因组突变来说，RNA水平的干扰通常对于植物是不致死的；基于上述两个优点，使得VIGS技术十分适用于基因功能的检测。