[发明专利]一种利用双荧光素酶报告基因检测鸡IFN-α生物学活性的方法

权利要求书

1.一种利用双荧光素酶报告基因检测鸡IFN-α生物学活性的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1.利用双荧光素酶报告基因检测系统，将鸡Mx蛋白的启动子片段插入带有萤火虫荧光素酶的质粒中，构建表达萤光虫荧光素酶的重组质粒PGL 3basic-Mxp；

S2.将重组质粒PGL 3basic-Mxp与内参质粒海参荧光素酶的质粒pRL-TK共同转染至鸡细胞株中，用鸡α干扰素刺激转染后的细胞；

S3.检测荧光素酶活性，通过检测荧光素酶的表达量，判断Mx蛋白的启动子的激活情况，从而检测鸡IFN-α生物学活性。

2.根据权利要求1所述的利用双荧光素酶报告基因检测鸡IFN-α生物学活性的方法，其特征在于，步骤S1中，所述的鸡Mx蛋白的启动子片段对应的序列如SEQ ID NO.1所示。

3.根据权利要求1所述的利用双荧光素酶报告基因检测鸡IFN-α生物学活性的方法，其特征在于，步骤S1中，所述的重组质粒PGL 3basic-Mxp的构建方法包括如下步骤：

(1)根据NCBI已公布的鸡Mx蛋白的启动子序列，设计PCR引物进行PCR扩增，得到扩增产物；

(2)将扩增产物进行双酶切，得到酶切产物，再通过分离、切胶回收纯化获得目的片段；

(3)将载体PGL 3basic进行双酶切，得到载体酶切产物，再通过分离、切胶回收纯化获得载体酶切产物；

(4)将步骤(2)得到的目的片段与步骤(3)得到的载体酶切产物进行连接，得到连接产物，将连接产物转化至大肠杆菌感受态细胞，然后将菌液涂于氨苄霉素LB板中培养，即得含有重组质粒PGL 3basic-Mxp的菌液；将含有重组质粒PGL 3basic-Mxp的菌液扩大培养，抽提质粒，得到重组质粒PGL 3basic-Mxp。

4.根据权利要求3所述的利用双荧光素酶报告基因检测鸡IFN-α生物学活性的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的PCR引物为如SEQ ID NO.2所示的上游引物Mxp-F和如SEQ IDNO.3所示的下游引物Mxp-R。

5.根据权利要求3所述的利用双荧光素酶报告基因检测鸡IFN-α生物学活性的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的PCR扩增反应条件为：95℃5min；95℃40s、55℃40s、72℃55s，35个循环；72℃7min。

6.根据权利要求3所述的利用双荧光素酶报告基因检测鸡IFN-α生物学活性的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的PCR扩增的体系为：Ex Taq酶25μL，浓度为10pmol/μL的上游引物Mxp-F 2μL，浓度为10pmol/μL的下游引物Mxp-R 2μL，浓度为40ng/μL的基因模板2μL，ddH₂O补足至50μL。

7.根据权利要求3所述的利用双荧光素酶报告基因检测鸡IFN-α生物学活性的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的双酶切的内切酶为NdeI和HindIII。

8.根据权利要求1所述的利用双荧光素酶报告基因检测鸡IFN-α生物学活性的方法，其特征在于，步骤S2中，所述的鸡细胞为鸡成纤维细胞；进一步为DF1细胞。

9.根据权利要求1所述的利用双荧光素酶报告基因检测鸡IFN-α生物学活性的方法，其特征在于，步骤S2中，所述的转染条件为：37℃、5％CO₂、95％湿度的环境中。

10.根据权利要求1所述的利用双荧光素酶报告基因检测鸡IFN-α生物学活性的方法，其特征在于，步骤S3中，质粒中Mx启动子的激活情况判断方法：分别读取萤火虫荧光素酶反应强度和内参海参荧光素酶反应强度的数值，根据读数计算Ratio＝RLU1/RLU2；然后进行T检验分析，若P0.01，即鸡α干扰素蛋白组和空白对照组相比，差异极显著，说明该鸡α干扰素能够刺激起始Mx蛋白启动子的转录，Mx蛋白的启动子被激活，鸡IFN-α具有生物学活性。