[发明专利]一种利用双荧光素酶报告基因检测鸡IFN-α生物学活性的方法

说明书

本发明公开了一种利用双荧光素酶报告基因检测鸡IFN‑α生物学活性的方法，属于干扰素活性检测技术领域。本发明利用双荧光素酶报告基因检测系统，将鸡Mx蛋白的启动子片段插入带有萤火虫荧光素酶的质粒中，构建表达萤光虫荧光素酶的重组质粒PGL 3 basic‑Mxp，通过检测荧光素酶的表达量，来判断Mx蛋白的启动子的激活情况，从而检测鸡IFN‑α生物学活性。本发明利用双荧光素酶报告基因检测鸡IFN‑α生物学活性的方法准确性好、可重复性高，成本低、操作简单，可实现鸡α干扰素的规模化生产。

技术领域

本发明属于干扰素活性检测技术领域，具体涉及一种利用双荧光素酶报告基因检测鸡IFN-α生物学活性的方法。

背景技术

鸡α干扰素(IFN-α)是一类能够广泛表达于多种单核细胞如巨噬细胞、树突状细胞及成纤维细胞等的细胞因子，在兽医临床中，因其具有抗病毒、抗肿瘤及免疫调节等多重功能而应用广泛。当病毒入侵动物体内，最先引起干扰素的分泌及抵御。干扰素的生物学功能主要有：增强免疫调节活性、抑制病毒增殖以及抑制肿瘤和相关细胞生长。干扰素功能多样，但过去由于干扰素生产成本较高，家禽若非重大疫病，较少使用干扰素，也就意味着干扰素在家禽养殖市场并没有充分地体现其使用价值。目前，有关制备鸡α干扰素的研究有很多，但如何检测制备出来的鸡α干扰素的活性成为当前的难题。

家禽干扰素(IFN)与人及其他动物差异较大，主要分为两大类：I型干扰素和II型干扰素，I型干扰素主要包括IFN-α、IFN-β、IFN-ω，II型干扰素主要是IFN-γ。其中鸡IFN主要有IFN-α、IFN-β、IFN-γ。I型IFN通过与IFN-α的细胞表面受体IFNAR结合，激发Janus激酶1(JAK1)和酪氨酸激酶2(TYK2)的磷酸化，磷酸化的JAK1和TYK2进一步磷酸化受体胞内酪氨酸残基，导致经过磷酸化的受体进一步募集和活化转录激活因子1和2(STAT1和STAT2)，磷酸化的STAT1和STAT2发生二聚化招募IRF9(IFN-stimulated factor 9)形成一个具有促进靶基因转录的三聚体复合物STAT1-STAT2-IRF9，也称干扰素基因激活因子ISGF3(IFN-stimulated gene factor 3)。IFN基因激活因子ISGF3转移至细胞核，进一步与DNA结合蛋白p48结合形成转录因子，即IFN刺激的反应元件ISREs(IFN-stimulated responseelements)被激活，从而开始干扰素刺激基因(IFN-stimulated gene，ISG)的转录。目前已经发现的ISG超过300种。

鸡α干扰素属于I型干扰素，能够通过JAK-STAT信号转导途径激活Mx启动子，表达Mx蛋白(Myxovirus resistance，Mx)，而Mx蛋白作为一种重要的ISG广泛参与许多RNA和DNA病毒的初期复制，其通过识别病毒的核衣壳蛋白阻止病毒进入核内，从而抑制病毒的复制，起到抗病毒作用。

因此，有望利用Mx启动子进行检测鸡IFN-α生物学活性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用双荧光素酶报告基因检测鸡IFN-α生物学活性的方法。

本发明的上述目的，通过以下技术方案予以实现：

一种利用双荧光素酶报告基因检测鸡IFN-α生物学活性的方法，包括如下步骤：

S1.利用双荧光素酶报告基因检测系统，将鸡Mx蛋白的启动子片段插入带有萤火虫荧光素酶的质粒中，构建表达萤光虫荧光素酶的重组质粒PGL 3 basic-Mxp；

S2.将重组质粒PGL 3 basic-Mxp与内参质粒海参荧光素酶的质粒pRL-TK共同转染至鸡细胞株中，用鸡α干扰素刺激转染后的细胞；

S3.检测荧光素酶活性，通过检测荧光素酶的表达量，判断Mx蛋白的启动子的激活情况，从而检测鸡IFN-α生物学活性。