[发明专利]人类输卵管上皮细胞的培养方法

权利要求书

1.人类输卵管上皮细胞的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一，将手术切下来的输卵管纵向剖开，置于Ham F12缓冲液中去除输卵管侧面多余的肉；

步骤二，将步骤一处理后的输卵管置于消化液中消化14-20h；

步骤三，终止消化后，颠倒，吸取上层液体，离心，置于加有10％FBS的基础培养基中预贴壁培养3-5h；

步骤四，预贴壁培养后，将上皮细胞转移至完全培养基中培养至细胞长密；

步骤五，对步骤四中长密的细胞进行饥饿处理培养分化纤毛；

步骤六，收取样品；

其中，所述消化液为包含左旋谷氨酰胺、青霉素和链霉素的Ham F12培养基、蛋白酶E以及DNA酶I；

所述完全培养基包括基础培养基、胰岛素、转铁蛋白、霍乱毒素、上皮细胞生长因子(EGF)、牛脑垂体提取物、胚牛血清(FBS)、视黄酸(RA)和原代细胞抗生素。

2.根据权利要求1所述的人类输卵管上皮细胞的培养方法，其特征在于，所述胰岛素的浓度为10μg/ml，所述转铁蛋白的浓度为5μg/ml，所述霍乱毒素的浓度为0.1μg/ml，所述EGF的浓度为25ng/ml，所述牛脑垂体提取物的浓度为30μg/ml。

3.根据权利要求1所述的人类输卵管上皮细胞的培养方法，其特征在于，所述基础培养基的配制方法为在含有15mM HEPES和L-谷氨酰胺的DMEM/Ham's F-12培养基中加入0.072mol/l NaHCO₃、0.08mol/l L-谷氨酰胺、100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素。

4.根据权利要求1所述的人类输卵管上皮细胞的培养方法，其特征在于，步骤一中的所述输卵管主要取自壶腹部。

5.根据权利要求1所述的人类输卵管上皮细胞的培养方法，其特征在于，步骤二所述消化的时间为16-18h。

6.根据权利要求1所述的人类输卵管上皮细胞的培养方法，其特征在于，步骤三中培养至原纤维细胞贴壁。

7.根据权利要求1所述的人类输卵管上皮细胞的培养方法，其特征在于，步骤四所述细胞长密的状态为细胞与细胞间挤得紧紧的，呈现方型，而且细胞很小。

8.根据权利要求1所述的人类输卵管上皮细胞的培养方法，其特征在于，步骤五中所述饥饿处理培养的时间为1-2天，所使用的培养基为基础培养基加入体积占比为2％的血清替代品和.08mol/l L-谷氨酰胺、100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素。