[发明专利]人类输卵管上皮细胞的培养方法

说明书

本发明公开了一种人类输卵管上皮细胞的培养方法，包括如下步骤：获取壶腹部输卵管组织，置于消化液中消化；消化终止后，置于加有10％FBS的基础培养基中预贴壁培养3‑5h；预贴壁培养后，将上皮细胞转移至完全培养基中培养至细胞长密，然后进行饥饿处理培养2天收取细胞。本申请通过特定的消化液对输卵管组织进行完全消化，而且消化比较温和，不会破坏细胞的形态，此外，在培养过程中对培养基进行了优化。本发明通过上述培养方法，获得了大量的输卵管上皮细胞，而且纤毛分化比例高，为相关的研究提供了很大的便利。

技术领域

本发明涉及细胞培养技术领域，尤其涉及一种人类输卵管上皮细胞的培养方法。

背景技术

输卵管一直被认为是被动的生殖，作为受精的场所和运输配子和着床前胚胎的通道。越来越多的证据表明，输卵管还调节精子的功能，并促进着床前胚胎的发育。输卵管的后几种功能是由其上皮细胞介导的。输卵管的管腔内衬有由分泌细胞和纤毛细胞组成的柱状上皮，分泌细胞和纤毛细胞在调节异种生殖的上皮表面方面都具有关键作用。分泌细胞产生的粘液、纤毛的摆动促进配子的运输。这些细胞类型在输卵管不同区域的比例在生殖周期中发生变化。尤其是壶腹区的上皮细胞正在积极合成和分泌各种分子到输卵管的腔内，包括补体蛋白-3和半月形细胞和腮腺蛋白，已知这些分子可以刺激着床前胚胎的发育。此外，最近的研究表明，一些浆液性卵巢癌可能来自输卵管上皮。

原位输卵管壶腹部上皮中以纤毛上皮细胞为主，另一种类型的上皮细胞为分泌型上皮细胞。已经有人提出，输卵管纤毛细胞是由分泌样表型的细胞分化而来的。众所周知，体外培养的输卵管上皮细胞失去了与原位上皮相关的形态学特征，包括纤毛。目前尚不清楚在原代培养中缺乏纤毛细胞是由于这些细胞未能粘附和存活，还是由于体外衰退或去分化的过程。对于纤毛细胞和分泌细胞分化的分子机制，气管具有与输卵管相似的上皮结构，是具有代表性的模型。一些研究表明，Notch信号控制纤毛细胞和分泌细胞的平衡。在发育中的气道中，Notch激活成功地以牺牲纤毛细胞为代价来驱动分泌细胞的形成，而Notch信号的抑制导致纤毛细胞数量的增加和伴随的分泌细胞生成的减少。Rachel W.S.关于人生殖系统上皮细胞培养，其结果中并未明显展示输卵管原代上皮细胞中发现纤毛。HisaoAndo等人建立了永生化的输卵管上皮细胞系，命名为NT/T-S，根据其结果可发现纤毛与微绒毛，但其纤毛细胞分化比例较低。Maobi Zhu等人根据气管上皮培养模型提出了关于猪输卵管原代上皮细胞培养方法，但由于培养皿限制，其细胞数量较少。

我们根据上述培养方法存在的不足，拟提供一种人类输卵管上皮细胞的培养方法，对输卵管原代上皮细胞的培养方法进行改良。

发明内容

本发明为解决现有技术中的上述问题提出的一种人类输卵管上皮细胞的培养方法，改良了关于输卵管原代上皮细胞步骤，纤毛分化比例高，更利于后续实验及研究。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明的第一个方面是提供一种人类输卵管上皮细胞的培养方法，包括如下步骤：

步骤一，将手术切下来的输卵管纵向剖开，置于Ham F12缓冲液中去除输卵管侧面多余的肉；

步骤二，将步骤一处理后的输卵管置于消化液中消化14-20h；

步骤三，终止消化后，颠倒，吸取上层液体，离心，置于加有10％FBS的基础培养基中预贴壁培养3-5h；

步骤四，预贴壁培养后，将上皮细胞转移至完全培养基中培养至细胞长密；

步骤五，对步骤四中长密的细胞进行饥饿处理培养分化纤毛；

步骤六，收取样品；

其中，所述消化液2700ul Ham F12培养基(+左旋谷氨酰胺+青霉素+链霉素)+300ul蛋白酶E+9ul DNA酶I；