[发明专利]一种多糖的液相色谱质谱联用分析检测方法及其应用

说明书

本发明公开了一种高分子量多糖的分析检测方法，使用液相色谱高分辨质谱联用技术检测分析。首先将多糖待测物经过尺寸排阻色谱进行分离后，多糖在质谱的离子源内通过源内裂解的方式初步碎裂；然后采用MS^ALL质谱采集方法，将离子源内产生的所有离子传输至碰撞池内进行高能碰撞诱导解离裂解，产生高丰度的系列特征寡糖离子碎片，采集特征寡糖碎片并据此定量检测高分子量多糖。本发明通过结合质谱的源内裂解和碰撞池内裂解两种离子碎裂方式，能够获得高丰度的特征寡糖离子碎片。采用高分辨率质谱数据能够有效排除内源性基质的干扰。本发明无需选择特定质荷比的母离子，能够解决高分子量多糖的多分散性带来的母离子难以选取的问题。

技术领域

本发明属于药物分析研究技术领域，涉及到分析高分子量多糖的生物质谱方法。

背景技术

随着糖化学与糖生物学研究的不断加深，多糖的药学研究亦有了长足的进步。但是，目前的研究多数都集中在多糖的分离纯化、化学组成和药理活性等方面，多糖的定量研究仍有许多尚未阐明的问题，目前仍缺乏灵敏、准确且可靠的分析方法。由于多糖的结构复杂且分子量较大，体内的内源性相似多糖也会对测定造成干扰，多糖的定量分析一直是药物分析领域的难题。近年来，为适应药物研发的需要，药物分析科学和技术得到了长足的发展。近年来，迅速发展的液相色谱串联质谱技术为多糖的分析提供了可能。与传统的免疫学、HPLC、比色法等相比，液相色谱串联质谱方法在准确度、精密度、选择性、灵敏度和定量动态范围等各方面均显示出较大优势。目前，多糖的质谱定量分析技术较少，其主要原因是由于高分子量多糖待测物具有多分散性以及电喷雾离子源易产生多电荷离子的特性，多糖在离子源中将产生无数个母离子。而基于MRM等扫描模式的LC-MS/MS手段只能对有限的和分子量确定的目标化合物进行定量分析。因此，对多组分多形态的高分子多糖进行质谱分析存在着很大的挑战性。源内裂解技术能够产生一定的特征寡糖碎片离子，并利用这些特征寡糖碎片离子来对多糖进行定性分析，或用于MRM扫描模式来实现定量分析。但是，由于源内裂解的能量较小，In-source CID的碰撞效率有所限制，产生的特征寡糖碎片离子的丰度并不高。高分辨率质谱的MS^ALL采集技术是近年来发展的一种新的质谱数据采集方式。MS^ALL采集技术的工作理念是采用母离子对应的特征碎片离子的高分辨数据进行检测，其工作原理是在四极杆对母离子不做选择，将全部母离子传输至碰撞池进行高能碰撞诱导解离，并高效率的产生大量的碎片离子，然后将所有的碎片离子进行高分辨质谱扫描并提取特征碎片离子进行定量或定性分析。MS^ALL采集技术能够弥补In-source CID的碰撞效率不足的缺点，其具有高碰撞能量，能够产生大量的特征寡糖碎片离子。本发明通过结合质谱的源内裂解和碰撞池内裂解两种离子碎裂方式，能够获得高丰度的特征寡糖离子碎片。采用Orbirap质量分析器获得高分辨率质谱数据，能够有效排除内源性基质的干扰。本发明无需选择特定m/z的母离子，在一定程度上规避了多糖m/z分布错综复杂带来的质谱定量分析难题，使用多糖对应的特征寡糖离子碎片完成高分子量多糖的定性及定量分析。

发明内容

由于高分子量多糖待测物具有多分散性以及电喷雾离子源易产生多电荷离子的特性，多糖在离子源中将产生无数个母离子(见图1)。本发明要解决的技术问题是，建立一种可以不需要选择母离子，且能够产生高丰度的特征离子碎片的技术方案，并根据对应的特征离子碎片完成多糖的定性及定量分析。本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种高分子量多糖的质谱分析检测方法，其特征在于：使用尺寸排阻色谱—电喷雾—四极杆—Orbitrap质谱(SEC-ESI-Q-Orbitrap)进行分析检测。含有多糖的样品经尺寸排阻色谱分离后，在质谱的离子源内通过源内裂解的方式进行初步碎裂(见图2)；然后采用MS^ALL的质谱采集方法，所有离子进入碰撞池内进行高能碰撞诱导解离裂解，进而产生一系列特征寡糖离子碎片(见图3)，通过对特征寡糖离子碎片进行扫描分析进而对多糖待测物进行定量检测。