[发明专利]一种快速检测PRPP的方法及其使用的生物传感器

说明书

本发明公开了一种快速检测5‑磷酸核糖‑1‑焦磷酸(PRPP)的方法及其使用的生物传感器。本发明基于配体结合蛋白与荧光蛋白耦合的方法，利用次黄嘌呤‑鸟嘌呤磷酸核糖转移酶HGPRT作为配体结合域和GFPmut2荧光蛋白作为报告基因耦合构建了PRPP传感器质粒Tp01。将Tp01导入到野生型大肠杆菌MG1655中，通过胞外添加不同浓度的PRPP，建立了PRPP与荧光强度的有效关系。该生物传感器可以用于筛选生产PRPP或PRPP下游产物的菌株。本发明具有重要的应用价值。

技术领域

本发明涉及一种快速检测5-磷酸核糖-1-焦磷酸(PRPP)的方法，属于分子检测领域。

背景技术

微生物合成途径提供了从廉价的可再生资源到有价值代谢产物的平台，如药品和塑料制品的生产。识别代谢途径潜在的限速步骤对调控目标产物的代谢流具有非常重要的指导意义，特别是检测代谢途径中的关键酶或者中间代谢物对代谢途径改造及评价至关重要。PRPP是由磷酸戊糖途径(PPP,pentose phosphate pathway)中的重要物质5-磷酸核糖经PRPP焦磷酸激酶催化与ATP反应而生成的，是核苷酸合成的极其重要的前体，同时也是维生素和色氨酸等合成途径中一个重要的前体物质^1,2(文献1：Acevedo-Rocha,C.G.etal.Microbial cell factories for the sustainable manufacturing of Bvitamins.Current opinion in biotechnology 56,18-29(2019).文献2：Schuster,S.,Dandekar,T.Fell,D.A.Detection of elementary flux modes in biochemicalnetworks:a promising tool for pathway analysis and metabolicengineering.Trends in biotechnology 17,53-60(1999).)。因此，建立对PRPP的检测方法对很多有价值的代谢产物的生产具有重要意义。

现在普遍运用的HPLC、LC-MS和Western blot等检测技术不仅繁琐而且不能及时检测分子浓度。特别是在高通量筛选高产菌株的过程中，代谢物检测大大限制了筛选效率。能够在体内感知和响应小分子的生物传感器在生物研究和生物技术中有着广泛的应用。生物传感器是在筛选中具有高通量鉴别小分子的优势，并且稳定性好，易于操作，为昂贵的体外筛选提供了廉价的替代品。基因编码生物传感器在筛选酶、优化生物合成途径、代谢物浓度测定和小分子触发治疗反应等方面具有潜在的应用价值，因此，配备基于荧光的遗传电路设备的高通量筛选生物传感器具有很好的开发前景。

发明内容

本发明的目的是快速检测PRPP。

本发明首先保护蛋白质，为C1)或C2)或C3)或C4)或C5)：

C1)氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示的蛋白质；

C2)将C1)所示的蛋白质氨基酸序列中第16位的氨基酸残基进行置换，得到的蛋白质；

C3)将C1)所示的蛋白质氨基酸序列中第26位的氨基酸残基进行置换，得到的蛋白质；

C4)将C1)所示的蛋白质氨基酸序列中第7位、第8位、第10位、第13位、第16位、第17位、第19位、第20位、第25位、第26位、第28位、第29位、第206位、第207位和第208位这15位中至少一位的氨基酸残基进行置换，得到的蛋白质；

C5)在C1)或C2)或C3)或C4)所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。

所述蛋白质可满足(X1)和/或(X2)：

(X1)可与PRPP结合；