[发明专利]一种检测羊包虫病ELISA抗体检测试剂盒及其应用

权利要求书

1.羊包虫病ELISA抗体检测试剂盒，包括细粒棘球蚴鸡尾酒抗原预包被酶标板、阳性对照液、阴性对照液、酶标记物浓缩液、酶标记物稀释液、样本稀释液、底物A液、底物B液、终止液、洗涤液、血清稀释板；所述细粒棘球蚴鸡尾酒抗原是由EPC1重组抗原、EgAgB1重组抗原、EgAgB2重组抗原和EgAgB4重组抗原组成；

所述的羊包虫病ELISA抗体检测试剂盒的制备方法包括如下步骤：

1)细粒棘球蚴鸡尾酒抗原的制备：以细粒棘球蚴cDNA文库为模版，针对EPC1、EgAgB1、EgAgB2和EgAgB4基因序列设计特异性引物，通过PCR扩增目的片段并克隆至表达载体pET28a，将成功构建的重组表达质粒pET28a-EPC-1、pET28a-EgAgB1、pET28a-EgAgB2和pET28a-EgAgB4转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，IPTG诱导表达，经亲和层析和分子筛层析高度纯化后得到EPC1重组蛋白、EgAgB1重组蛋白、EgAgB2重组蛋白和EgAgB4重组蛋白；

2)细粒棘球蚴鸡尾酒抗原预包被酶标板的制备：将鸡尾酒抗原用碳酸盐缓冲液稀释成浓度为5μg/mL的抗原包被液，每孔100μL，2-8℃包被16h后洗板；然后每孔加入200μL封闭液，37℃、湿度30-40％封闭2h，37℃、湿度30-40％恒温干燥2h；所述细粒棘球蚴鸡尾酒抗原中由EPC1重组抗原、EgAgB1重组抗原、EgAgB2重组抗原和EgAgB4重组抗原，终浓度分别为2.8mg/mL、1.4mg/mL、2.8mg/mL和1.4mg/mL；

3)阳性对照液的制备：试验用羊攻虫270日血清1:100倍稀释；

4)阴性对照液的制备：健康绵羊血清1:100倍稀释；

5)酶标记物浓缩液的制备：辣根过氧化物标记的Mouse Anti-goat IgG-HRP 1:30000倍稀释；

6)酶标记物稀释液的制备：0.01M pH7.4的PBST溶液；

7)样品稀释液的制备：0.01M pH7.4的PBS溶液；

8)底物A液的制备：含0.08％过氧化脲、0.025％PEG-2000、3.58％十二水合磷酸氢二钠、0.96％一水合柠檬酸水溶液，调pH值至7.4；

9)底物B液的制备：含1.03％一水合柠檬酸、0.04％TMB、0.0008％硫代硫酸钠、0.1％光稳定剂292、3％DMF水溶液，调pH值至5.0；

10)终止液的制备：含0.1％10％SDS、5.56％硫酸水溶液；

11)洗涤液的制备：0.25M pH7.4的PBST溶液；

所述的针对EPC1基因序列设计的特异性引物如序列表的序列1-2所示，EPC1重组抗原核酸序列如序列表的序列9所示；所述的针对EgAgB1基因序列设计的特异性引物如序列表的序列3-4所示，EgAgB1重组抗原核酸序列如序列表的序列10所示；所述的针对EgAgB2基因序列设计的特异性引物如序列表的序列5-6所示，EgAgB2重组抗原核酸序列如序列表的序列11所示；所述的针对EgAgB4基因序列设计的特异性引物的如序列表的序列7-8所示，EgAgB4重组抗原核酸序列如序列表的序列12所示。

2.根据权利要求1所述的羊包虫病ELISA抗体检测试剂盒，酶标板材质为96孔固相酶标板NUNC-468667。