[发明专利]振荡型基因表达系统、构建方法及其在鼠李糖脂发酵中的应用

权利要求书

1.振荡型基因表达调控质粒pOSC，其特征在于，通过在载体pTD103基础上删除多余的启动子PluxR和基因LuxR，并且在启动子PluxI上游反向插入启动子Ptet得到，由此形成启动子Ptet及启动子PluxI启动的两条代谢调控通路；所述的启动子Ptet启动的代谢调控通路包含启动子Ptet、应答调节因子基因LuxR；所述的启动子PluxI启动的代谢调控通路包含启动子PluxI、靶基因sfGFP、阻遏基因tetR、蛋白降解标签基因ssrA和调节基因LuxI。

2.合成鼠李糖脂的振荡型基因表达调控质粒pOSC-rh1AB，其特征在于，通过将权利要求1所述的振荡型基因表达调控质粒pOSC的靶位点上的标记基因sfGFP替换为表达鼠李糖脂的鼠李糖基转移酶基因rh1AB得到。

3.根据权利要求1所述的振荡基因表达调控质粒pOSC的构建方法，其特征在于，具体步骤如下：

(1)以质粒pTD103为DNA模板，利用引物sfGFPFor、PtetRev扩增1Kb的T1-sfGFP-PluxI-Ptet序列；

(2)用限制性内切酶EcoRI对质粒pTD103进行酶切，回收纯化酶切后的3.6Kb载体片段luxR-kan-ColE1-luxI；

(3)通过Gibson assembly将步骤(1)与步骤(2)中纯化回收的片段进行连接形成新的质粒载体，即获得质粒pTD-Ptet；

(4)以质粒pTD-Ptet为DNA模板，利用引物LuxRfor、gfpRev扩增片段，删除PluxR，利用Nhel对PCR扩增片段进行酶切，利用T4连接酶进行连接，获得质粒pTD-ptet2；

(5)用HindIII和KpnI对pTD-Ptet2进行双酶切，回收纯化3.4Kb载体片段luxI-colE1-kan-LuxR；

(6)以大肠杆菌XL1-Blue基因组DNA为模板，利用引物tetRFor、tetRRev扩增tetR基因片段，对tetR的PCR扩增产物用HindIII和KpnI双酶切；

(7)通过T4连接酶将步骤(5)与步骤(6)中的酶切片段进行连接形成新的质粒载体，即获得质粒pTD-tetR；

(8)以质粒pTD-ptet2为DNA模板，利用引物gfpFor、gfpRev扩增sfGFP标记基因，用HindIII对sfGFP的PCR片段和pTD-tetR进行酶切；

(9)通过T4连接酶将步骤(8)酶切片段进行连接形成新的质粒载体，即获得质粒pOSC。

4.根据权利要求2所述的合成鼠李糖脂的振荡型基因表达调控质粒pOSC-rh1AB的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)以铜绿假单胞菌PAO1基因组DNA为模板，利用引物rhalABFor，rhalABRev扩增2.2Kb的鼠李糖基转移酶基因rh1AB；

(2)以振荡型基因表达质粒pOSC为模板，以pTD-tetFor1、pTD-tetRev1为引物扩增2.3Kb的tetR-LuxI-ColE1片段，以pTD-tetFor2、pTD-tetRev2为引物扩增2.0Kb的kanR-luxR-Ptet片段；

(3)通过Gibson assembly将步骤(1)和步骤(2)中纯化回收的三个片段进行连接形成新的质粒载体，即获得质粒pOSC-rh1AB。

5.鼠李糖脂的大肠杆菌振荡型基因表达系统，其特征在于，通过将权利要求2所述的合成鼠李糖脂的振荡型基因表达调控质粒pOSC-rh1AB转入大肠杆菌中得到。

6.根据权利要求5所述的鼠李糖脂的大肠杆菌振荡型基因表达系统在生产鼠李糖脂中的应用。