[发明专利]振荡型基因表达系统、构建方法及其在鼠李糖脂发酵中的应用

说明书

本发明公开了一种振荡型基因表达系统、构建方法及其在鼠李糖脂发酵中的应用。所述的振荡型基因表达系统含有启动子PluxI，阻遏基因tetR，启动子Ptet，应答调节因子基因LuxI和LuxR，蛋白降解标签基因ssrA。通过调控基因表达的周期性开关过程，振荡型基因表达系统可以缓解稳定生长期大肠杆菌代谢中间产物及能量的供给压力，使基因表达与底物供给达到平衡，进而提高次级代谢产物的产量。本发明通过在振荡型基因表达调控质粒中导入鼠李糖脂生物合成途径相关基因，实现鼠李糖脂在大肠杆菌中的异源合成，构建得到的高产鼠李糖脂的振荡型基因表达系统的工程菌，发酵产量达838mg/L。

技术领域

本发明涉及一种振荡型基因表达系统、构建方法及其在鼠李糖脂发酵中的应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

大肠杆菌作为一种重要的革兰氏阴性模式菌株，具有非致病性、构造相对简单、遗传背景清晰、容易分离培养等特性，常作为模式生物参与生物实验或作为基因工程的对象加以利用，是异源表达和分泌次级代谢产物的理想宿主。

鼠李糖脂(Rhamnolipid)是一种结晶酸，属于阴离子表面活性剂，是由一个或两个鼠李糖与3-羟基脂肪酸以糖苷键相连而构成的两亲性分子。鼠李糖脂的种类繁多，化学结构多种多样，目前已发现多达60种鼠李糖脂的同系物，这些同系物的主要区别在于饱和(C-C)和不饱和(C＝C)脂肪酸链的长度的差异，由C8到C14不等。根据鼠李糖分子数目的不同，可以将其分为单鼠李糖脂Rha-C10、Rha-C10-C10和双鼠李糖脂 Rha-Rha-C10、Rha-Rha-C10-C10。鼠李糖脂具有优越的表/界面活性，可大大降低两相间的表面张力，具有乳化、发泡、洗涤等功效，在农业、环境保护、医药化妆品、食品、精细化工等领域有非常广泛的应用前景。

鼠李糖脂广泛存在于假单胞菌属细菌中，常以铜绿假单胞菌为主要菌种进行发酵得来。铜绿假单胞菌可在不同的碳底物上生长，有着非常优良的生产鼠李糖脂的能力，然而铜绿假单胞菌是一种无处不在的环境细菌，同时也是一种机会性致病菌，其工业应用有限，很难大规模的生产。并且由于涉及到鼠李糖脂生产转录调控网络的QS系统的复杂性，使得筛选铜绿假单胞菌高产菌株成为了一个很难完成的任务。有研究表明，鼠李糖基转移酶基因可以在大肠杆菌中有效表达。文献1(Wang QH,Fang XD,Bai BJ,et al. Engineeringbacteria for production of rhamnolipid as an agent for enhanced oil recovery[J]. BiotechnologyBioengineering,2007,98(4):842-53)通过转座子介导的方法将rh1AB操纵子整合到大肠杆菌BL21(DE3)的基因组中，经IPTG成功诱导表达出鼠李糖脂，产量约为0.080g/L。文献2(Cabrera-Valladares N,Richardson AP,Olvera C,et al.Monorhamnolipids and 3-(3-hydroxyalkanoyloxy)alkanoic acids(HAAs)productionusing Escherichia coli as a heterologous host.Appl Microbiol Biot[J].AppliedMicrobiology Biotechnology,2006,73(1):187-94)利用rh1AB操纵子和rmlBDAC操纵子(铜绿假单胞菌鼠李糖合成基因簇)成功表达鼠李糖脂，产量约为0.121g/L。文献3(HanL,Liu P, Peng Y,et al.Engineering the biosynthesis of novel rhamnolipids inEscherichia coli for enhanced oil recovery[J].Journal of AppliedMicrobiology,2014,117(1):139-50)通过整合不同的鼠李糖脂合成相关基因，构建不同的产鼠李糖脂的质粒载体，转入大肠杆菌BL21 (DE3)发酵得到最高产量为0.120g/L。文献4(Du J,Zhang A,Hao J A,et al.Biosynthesis of di-rhamnolipids and variations ofcongeners composition in genetically-engineered Escherichia coli[J].Biotechnology letters,2017,39(7):1041-8)在大肠杆菌中将rfbD和 rhlAB-rhlC共过量表达鼠李糖脂，将产量由0.446g/L提高至0.64g/L。上述方法虽然将产鼠李糖脂的相关基因导入大肠杆菌，并验证了异源合成鼠李糖脂的可行性，但是鼠李糖脂在大肠杆菌中的产量较低，并且由于合成鼠李糖脂的前体物质大多来自于大肠杆菌的中心代谢途径，细菌过量表达鼠李糖脂会影响细菌本身的生长代谢。